Выделение мышью перитонеальных клеток полости
28 января 2010 г.
Брюшной полости у млекопитающих содержит различные иммунные клеточные популяции важно для врожденного иммунного ответа. Эффективный метод изоляции требуется для биохимических и функциональных анализов этих клеток. Здесь мы предлагаем комплексный метод для изоляции брюшной полости в клетках мыши.
Изоляция клеток брюшной полости начинается с размещения эвтаназированной мыши на спине. Нарезают наружный слой кожи брюшины и осторожно оттягивают его, чтобы обнажить внутренний слой. В брюшную полость вводят PBS с 3% FBS, после чего осторожно массируют брюшину. Жидкость, содержащую клетки брюшной полости, собирают и помещают в пробирку объемом 15 миллилитров на льду.
Клетки промывают один раз и подсчитывают с помощью гемоцитометра. Здравствуйте, я Оджи из лаборатории доктора Бона в Институте исследования крови Центра крови Висконсина. Сегодня мы продемонстрируем процедуру выделения клеток из брюшной полости мыши.
Мы используем данную процедуру в нашей лаборатории для получения клеток для различных фенотипических, биохимических и иммунологических анализов. В первую очередь нас интересуют популяции B-клеток брюшины. Итак, приступим.
Перед началом изоляции иммунных клеток из брюшной полости подготовьте все необходимые материалы. Сначала подготовьте ведро со льдом, шприц объемом 5 мл с иглой 27 G, шприц объемом 5 мл с иглой 25 G, пенопластовый блок и булавки для фиксации мыши. Также подготовьте поднос для размещения блока, ножницы, пинцет и пробирки для сбора образцов перед проведением диссекции.
Заранее охладите PBS, содержащий 3% сыворотки теленка. Держите этот раствор и пробирки для сбора на льду на протяжении всего эксперимента. После введения анестетика и проведения соответствующей эвтаназии опрыскайте мышь 70% этанолом и уложите ее на спину на пенопластовый блок или препаровальный коврик. С помощью пинцета и ножниц рассеките кожу брюшной стенки.
Осторожно оттяните кожу, чтобы обнажить внутренний слой кожи, выстилающий брюшную полость. Осторожно, стараясь не проколоть внутренние органы, медленно введите иглу 27 gauge в брюшину. Введите пять milliliters ледяного PBS в брюшную полость.
Теперь осторожно помассируйте брюшину, чтобы стимулировать отделение клеток от брюшной стенки и их попадание в раствор PBS. Затем возьмите шприц объемом 5 мл с иглой 25 G, направив срез иглы вверх, и введите её в брюшину. Соберите как можно больше жидкости, чтобы увеличить выход клеток.
Во время выполнения этой процедуры осторожно перемещайте наконечник, чтобы жировая ткань или другие органы не забили иглу. Извлеките иглу и перенесите клеточную суспензию в полипропиленовые пробирки для сбора. Соберите оставшуюся жидкость из полости, сделав надрез на внутренней стороне брюшины.
Используйте пинцет, чтобы раздвинуть кожу, и с помощью пластической пастернауэровской пипетки соберите оставшуюся жидкость. В завершение центрифугируйте клеточную суспензию в течение восьми минут при 1500 RPM, удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в пяти миллилитрах PBS. Проведите подсчет клеток с помощью гемоцитометра.
Использование метода исключения трипанового синего позволит определить количество клеток. Как правило, из необработанной мыши можно выделить от 5 до 10 миллионов клеток брюшной полости. От 50 до 60% от общей популяции клеток будут составлять B-клетки.
Около 40% будут составлять макрофаги и гранулоциты, а от 5 до 10% — Т-клетки. Мы только что продемонстрировали вам способ выделения клеток из брюшной полости мыши. При использовании данной процедуры важно ограничить количество крови в популяции клеток брюшной полости, осторожно усыпляя мышей и избегая повреждения органов брюшной полости.
Обязательно утилизируйте любые образцы, загрязненные кровью. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Обзор
В данной статье представлен подробный метод выделения клеток из брюшной полости мышей, который имеет важное значение для изучения иммунных ответов. Процедура разработана таким образом, чтобы обеспечить сохранность клеточных популяций для последующих анализов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточная биология
- Биохимия
Теоретические основы
- В брюшной полости содержится несколько типов иммунных клеток.
- Эти клетки играют жизненно важную роль в реакциях врожденного иммунитета.
- Методы выделения имеют решающее значение для функциональных и биохимических исследований.
- Изучение этих клеток может помочь в иммунологических исследованиях.
Цель исследования
- Обеспечить надежный метод выделения клеток из брюшной полости.
- Облегчить изучение популяций иммунных клеток у мышей.
- Повысить точность последующих иммунологических анализов.
Используемые методы
- Эвтаназия мыши и подготовка к диссекции.
- Инъекция PBS с 3% FBS в брюшную полость.
- Сбор жидкости, содержащей клетки брюшины.
- Центрифугирование и подсчет выделенных клеток.
Основные результаты
- Успешно выделено от 5 до 10 миллионов клеток брюшной полости.
- Установлено, что 50–60% клеток являются B-клетками.
- Примерно 40% составляют макрофаги и гранулоциты.
- От 5 до 10% клеток являются T-клетками.
Выводы
- Данный метод эффективен для выделения иммунных клеток из брюшной полости.
- Тщательное проведение эвтаназии и диссекции имеет решающее значение для предотвращения загрязнения крови.
- Эту процедуру можно применять в различных иммунологических исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Выделение иммунных клеток из брюшной полости позволяет проводить валидацию мишеней на ранних этапах, обеспечивая доступ к фенотипически определенным субпопуляциям B-клеток и макрофагов. Это способствует снижению механистических рисков в процессах поиска новых лекарственных средств за счет получения воспроизводимого первичного клеточного материала для функциональных анализов. Данный метод повышает прогностическую достоверность при идентификации ведущих соединений благодаря стандартизированному выделению популяций иммунных клеток, имеющих значение для скрининга иммуномодулирующих препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: Позволяет проводить анализ субпопуляций клеток B1a и B1b для проверки терапевтических гипотез в моделях аутоиммунных заболеваний и инфекций.
- Научная ценность: Обеспечивает получение наивных тканевых макрофагов для уточнения путей реализации врожденного иммунного ответа.
- Практическая ценность: Способствует снижению биологических рисков за счет стабильного выделения популяций иммунных клеток для скрининга взаимодействия с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для фенотипического анализа методом проточной цитометрии и биохимического анализа.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет контролируемого выхода клеток (5–10 миллионов клеток на мышь).
- Практическая ценность: Обеспечение надежной оценки соединений посредством количественного выделения B-клеток (50–60%), макрофагов (40%) и T-клеток (5–10%).
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает моделирование систем, имеющих значение для изучения заболеваний, за счет выделения аутореактивных B1-клеток и регуляторных субпопуляций, продуцирующих IL-10.
- Практическая ценность: Способствует согласованию трансляционных биомаркеров посредством выделения естественных секретирующих IgM B1-клеток.
- Практическая ценность: Обеспечивает непрерывность доклинических исследований, предоставляя первичные иммунные клетки для последующего изучения механизмов в моделях заболеваний.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска лекарственных средств, обеспечивая получение первичных иммунных клеток для валидации мишеней, разработки анализов и доклинических исследований механизмов действия.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей путем выделения определенных субпопуляций B-клеток и макрофагов.
- Скрининг: Обеспечивает готовность к проведению анализа за счет стандартизированного выделения клеток и получения жизнеспособных популяций иммунных клеток.
- Аналитика: Позволяет проводить количественное сравнение субпопуляций клеток с помощью подсчета на гемоцитометре и методов исключения нежизнеспособных клеток.
- Трансляционные исследования: Связывает фундаментальные открытия с доклинической валидацией посредством выделения B1-клеток, связанных с естественным иммунитетом и регуляцией.
- Корпоративное использование: Создает возможность многократного использования метода получения иммунных клеток в различных программах по поиску лекарств в области иммунологии и онкологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышение прогностической уверенности в валидации мишени за счет доступа к фенотипически охарактеризованным иммунным субпопуляциям.
- Операционная ценность: стандартизация и воспроизводимость благодаря определенному выходу клеток и распределению субпопуляций.
- Стратегическая ценность: оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения механистической неопределенности при скрининге иммуномодуляторов.
- Влияние на портфель: приоритизация с учетом рисков за счет использования надежных исходных первичных клеток для панелей функциональных анализов.
Особенности реализации
- Требуются навыки препарирования мышей и соблюдение правил асептики для предотвращения повреждения органов и загрязнения образцов кровью.
- Процесс зависит от наличия инструментария, включая шприцы, иглы, центрифугу и гемоцитометр для обработки и подсчета клеток.
- Необходима стандартизация приготовления PBS/FBS и соблюдение условий холодовой цепи между всеми группами исследователей для обеспечения воспроизводимости результатов.
- Требуется учет особенностей адаптации метода при применении к моделям заболеваний, изменяющих клеточный состав брюшной полости.
- Метод ограничен необходимостью проведения тщательной эвтаназии и препарирования во избежание загрязнения кровью, что может нарушить целостность образца.
