Производство лентивирус

Эта процедура начинается с пересечения 2 9 3 Т-клеток лентивирусом, плазмидами и вирусными векторами упаковки, вирусная надосадочная жидкость собирается по прошествии не менее 48 часового инкубационного периода. После ультрацентрифугирования снат фильтруют для концентрирования с помощью ультрацентрифуги. Вирусную гранулу ресуспендируют с PBS для получения титра вируса, сначала разбавляют концентрированный вирус в полной среде, а затем выполняют серийное разведение для заражения клеток лентивирусом.

Здравствуйте, я Шейн Вонг из лаборатории Майкла Макмануса в Центре диабета Калифорнийского университета в Сан-Франциско. Меня зовут Майкл Макманус. Сегодня мы покажем вам процедуру производства лентивирусов.

Мы используем эту процедуру в лаборатории для получения лентивирусов для РНК-интерференции. Итак, приступим. Чтобы начать этот протокол, подготовьте ДНК, с помощью которой будут трансфицированы 2 9 3 Т-клетки.

Сначала разведите реагент для трансфекции гена FU шесть в пробирке объемом 1,5 миллилитра, смешав 30 микролитров Fuji six с 600 микролитрами свободной сыворотки среды. Будьте осторожны, не позволяйте Fuji касаться боковой стороны трубки, когда вы вводите ее в среду для инкубации комнатной температуры в течение пяти минут. Далее в колпачке пробирки смешайте четыре микрограмма лентивирусной плазмиды с 1,33 микрограмма.

Каждое третье поколение вирусных упаковочных векторов. Лентивирусная плазмида содержит ДНК. Вирус встраивается в геном каждой инфицированной клетки, в то время как упаковочные векторы содержат гены всех других белков, необходимых для того, чтобы вирус чечевицы закрыл крышку и перемешал, перевернув пробирку несколько раз.

Инкубируйте ДНК и реагент для трансфекции в течение 15-20 минут при комнатной температуре. Теперь пришло время трансфектировать 2 9 3 клетки с подготовленной вами ДНК с использованием клеток, которые вы поместили за 24 часа и которые достигли 50-70% плавности в пипетке для культуры тканей, вся подготовленная ДНК на планшете 2 9 3 аккуратно перемешан, наклоняя планшет вперед и назад, Верните клетки в инкубатор и позвольте вирусной продукции продолжаться в течение 48-96 часов до сбора урожая. Во время инкубации клетки 2 9 3 продуцируют лентивирусы, геномы которых содержат РНК-копию интересующей вас ДНК.

Теперь пришло время собрать вирус. Выньте клетки из инкубатора. Имейте наготове в тканевом культурном колпаке шприцевой фильтр на 0,4 или пять микрон, одноразовый шприц на 10 миллилитров и центрифужную пробирку UltraClear Beckman.

С помощью одноразового шприца удалите надосадочную жидкость, которая теперь содержит вирус. Прикрепите к наконечнику шприцевой фильтр 0,45 микрона и отфильтруйте вирус в центрифужную пробирку UltraClear Beckman. Фильтр пропускает только вирусы, а не клетки, прежде чем отбраковать, инкубировать все клетки, производящие вирусы.

Заквашивайте планшеты, шприцы и фильтры в 10% отбеливатель в течение 45 минут. Теперь, когда вы собрали и отфильтровали вирус, пришло время сначала сконцентрировать вирус с помощью ультрацентрифугирования. Используйте DMEM, не содержащую сыворотки, чтобы сбалансировать все вирусосодержащие пробирки с точностью до 0,2 грамма друг от друга.

Затем загрузите сбалансированные центрифужные пробирки в роторные ковши SW 41 TI или SW 28. Запечатайте ведра ротора и зацепите их за ротор. Затем поместите ротор внутрь ультрацентрифуги.

Вращайте вирус в течение примерно 90 минут при температуре четыре градуса Цельсия при 25 000 оборотах в минуту в роторе SW 41 TI или 24 000 об/мин в роторе SW 28. После центрифугирования вернитесь в колпак для культуры тканей и переверните пробирку, чтобы перелить SNAT в емкость, содержащую 10% отбеливателя. Используйте салфетку Кима, чтобы впитать лишнюю жидкость вокруг гранулы, и переверните трубку в удобной решетке не более чем на пять минут, пока не будете готовы снова суспендировать гранулу.

Чтобы ресуспендировать вирусную гранулу, с помощью фильтрующего наконечника добавьте в пробирку 100 микролитров стерильного предварительно отфильтрованного PBS. Затем проведите пипеткой вверх и вниз около 20 раз. Оставьте вирус при температуре четыре градуса на ночь до полной ресуспензии.

Вы можете хранить вирусные препараты при четырех градусах в течение примерно одной недели и при минус 80 градусах в течение одного года. Не забудьте обработать все пустые тюбики 10% отбеливателем перед выбросом. Если вы планируете использовать вирусный препарат дольше одной недели, он будет храниться в холодильнике.

Сделайте минимальные аликвоты от пяти до 20 микролитров для будущих экспериментов и одну аликвоту от трех до пяти микролитров для титрования, замораживайте и храните аликвоты при температуре примерно минус 80. Следующим этапом является определение титра вируса. Если вы включили флуоресцентный репортерный ген в лентивирусную плазмиду, инфицированные клетки будут флуоресцировать, и вы сможете определить титр вируса с помощью проточной цитометрии.

Для начала разведите три микролитра концентрированного вируса на 1,5 миллилитра полной среды в лунках, от одного до шести. В один ряд 96 лунок планшет. Выполните следующие последовательные разведения во все шесть лунок по 100 микролитров полного DM.To в первую лунку добавьте 100 микролитров среды без вируса.

Это ваш незапятнанный контроль. Ко второму хорошо добавляем 100 микролитров разведенного вируса к третьему. Хорошо добавляем 100 микролитров смеси со второй лунки на четвертую.

Ну и добавляем 100 микролитров из третьей лунки в пятую. Хорошо добавляем 100 микролитров из четвертой лунки и в шестую. Ну и добавляем 100 микролитров от пятого.

Ну, наконец, возьмите 100 микролитров из шестой лунки и выбросьте и отбеливайте, доведите общий объем во всех лунках до 200 микролитров с помощью DMEM. С каждым разведением концентрация вируса снижается вдвое. Обратите внимание, что это только рекомендуемые разведения, которые должны хорошо работать для титрования наиболее концентрированных вирусов.

Если ваш вирус имеет низкий титр или неконцентрированный, возможно, вам придется скорректировать разведения. Обработайте любой неиспользованный разведенный вирус 10% отбеливателем в течение 45 минут, прежде чем выбросить его в контейнер для биологически опасных отходов. Добавьте около 15 000 здоровых активно делящихся 2 9 3 Т-клеток в каждую из шести лунок.

Вы можете использовать одну 96-луночную пластину для титрования 16 вирусных препаратов, долить лунки до 200 микролитров, вернуть клетки в инкубатор и позволить инфекции протекать не менее 48 часов. После инкубации проанализируйте флуоресценцию клеток с помощью проточного цитометра. Вы можете использовать процентное содержание флуоресцентных клеток в лунке для определения титра или количества инфекционных вирусных частиц на миллилитр добавленного вируса.

Рассчитайте количество инфекционных единиц на миллилитр по следующей формуле при интерпретации потока. Результаты цитометра. Обратите внимание, что точные расчеты титра можно получить только в том случае, если инфицированные клетки получили не более одной вирусной интеграции на клетку.

Чтобы убедиться в этом, используйте для расчетов клетки с уровнем заражения менее 15%. Клетки с более высоким уровнем инфицирования, вероятно, получат несколько вирусных интегралов на клетку. Разведение, предложенное на втором шаге, должно дать несколько образцов в пределах этого диапазона инфекции.

В идеале используйте несколько образцов для создания графика титрования, на основе которого можно рассчитать окончательный титр. Для вычисления титра вируса можно использовать формулу, вычисленную по подогнанной линейной линии, но при необходимости можно рассчитать титр с использованием одного образца. Можно ожидать титр от 10 до седьмой единицы на миллилитр для неконцентрированного вируса и от 10 до 10 до восьмой единицы на миллилитр для концентрированного вируса.

Мы только что показали вам, как производить лентивирусы при выполнении этой процедуры. Важно соблюдать все правила биобезопасности и правильно утилизировать отходы. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.