Name: Производство лентивирус (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Узнайте метод производства лентивирусов с использованием клеток 293T человека. Этот протокол включает трансфекцию, ультрацентрифугирование и определение титра вируса флуоресценцией для генной терапии.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Сандлер Астма фундаментальных исследований Центра (SABRE) Сандлер фонда

Часть 1: Трансфекция HEK 293 клеток продуцировать лентивирусов * 24 часов до трансфекции, пластины 2,5 • 10 6 клеток в 10 см блюдо для слияния 50-70% на следующий день. <ol><li> Начало этому протоколу, подготовив ДНК, с которой позже один трансфекции клетки, чтобы сделать вирус. Во-первых, разбавленный FuGENE 6 Трансфекция реагента Roche, липидный реагентов, которые делают клетки занимают ДНК. В 1,5 мл трубки, пипетки 30μl FuGENE 6 в 600ul бессывороточной среде (SFDMEM). Будьте осторожны, чтобы не позволить FuGENE сенсорным стороне трубки, как он будет доставлен в среду. Пусть это FuGENE и SFDMEM перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут. </li><li> В крышку трубки, смешать 4 мкг лентивирусов плазмиду с 4 мкг каждого 3-го поколения вирусных векторов упаковки (pMDL, pRSV и pVSV-G). Лентивирусов плазмида содержит ДНК вируса будет вставить в геном каждой клетки она заражает, в то время как упаковка векторы содержат гены для всех других белков, необходимых, чтобы сделать лентивирусов. </li><li> Закройте крышку и перемешать путем обращения трубку несколько раз. </li><li> Инкубируйте 15-20 минут при комнатной температуре. </li><li> Внесите все содержимое тубы в 293 пластины. Осторожно перемешать, наклоняя пластину назад и вперед. </li><li> Вернуться клетки инкубатора и позволяют вирусная производства продолжаться в течение 48-96 часов до сбора урожая. </li><li> Во время инкубации клеток 293 расшифровать ДНК представляют интерес с лентивирусов плазмиды, создавая копию РНК лентивирусов конструкции. Они также расшифровать и перевести генов в упаковке векторов в вирусные белки. Эти белки действовать, чтобы вирусы содержащие РНК версию вашего лентивирусов конструкция, которая вирус будет обратный транскрибировать и вставьте в геномы всех клеток, он заражает. </li></ol> Часть 2: Harvest лентивирусов <ol><li> После инкубационного периода, взять клетки из инкубатора и использовать одноразовые, 10 мл шприца, чтобы удалить супернатант, который теперь содержит вирус. Там будет около 10 мл надосадочной жидкости. </li><li> Прикрепить 0.45μM фильтра шприц наконечник и фильтр вируса в трубке ультрацентрифуге Beckman. Фильтр позволяет только вирусы, а не клетки, чтобы пройти. </li><li> До списания, инкубировать все вирус-продуцирующие клетки, культуры пластин, шприцы и фильтры в 10% гипохлоритом натрия в течение 45 минут. </li></ol> Часть 3: лентивирусов Концентрация через ультрацентрифугирования <ol><li> Нагрузка пробирок в SW-41Ti или SW-28 ротор ведра. </li><li> Используйте бессывороточной DMEM, чтобы сбалансировать все вируссодержащих труб с точностью до 0,2 г. </li><li> Печать закрыть ротора ведра и подключить их на ротор перед размещением ротора внутри ультрацентрифуге </li><li> Спиновые вируса в течение 90 минут в ультрацентрифуге при 4 ° С при 25 000 оборотов в минуту в SW-41Ti ротора или 24000 оборотов в минуту в SW-28 ротор. </li><li> В капотом культуры ткани, инвертировать трубы вверх дном, чтобы вылить надосадочную в контейнер, содержащий 10% гипохлоритом натрия. </li><li> Используйте Kimwipe поглощать избыточную жидкость вокруг гранул и инвертировать трубка в удобной стойке не более чем на пять минут. </li><li> Чтобы снова приостановить вирусных гранул, используйте фильтр наконечника добавить 100 мкл стерильной PBS к трубе, то пипетку вверх и вниз примерно в 20 раз. </li><li> Оставьте вирус при температуре 4 ° С в течение ночи, чтобы полностью изменить подвеску. Можно хранить вирусных подготавливает на 4 градуса в течение 1 недели, а при температуре -80 градусов на срок до одного года. Не забывайте лечить все пустые трубы с 10% отбеливателя, прежде чем выбросить. </li><li> Если один намерен использовать вирусный приготовительный более чем на 1 неделю, сделать минимальный аликвоты 5-20 мкл для будущих экспериментов и 1 аликвоту от 3 до 5 мкл для титрования. Замораживание и хранение аликвот при температуре минус 80. </li></ol> Часть 4: лентивирусов титрования с использованием проточной цитометрии <ol><li> Следующим шагом является определение вирусного титра с помощью проточной цитометрии. Этот метод работает только в тех случаях, когда лентивирусов плазмида содержит ген флуоресцентного репортер. Идея заключается в том, когда вирус заражает клетку, он вводит лентивирусов плазмидной ДНК в геном, что клетки. Инфицированной клетки затем расшифровать и перевести генов, включенных в лентивирусов плазмиды, и если вы в том числе флуоресцентный ген репортер, инфицированные клетки и будут светиться. Уровень флуоресценции представляет потенцию, или титр вируса. </li><li> Для каждой вирусной акции должны быть оттитрованы, развести 3 мкл концентрированного вируса в 1,5 мл полной среды (DMEM, ручка-стрептококк, глутамин, ФБС). </li><li> В скважинах 1-6 в один ряд 96 ячейках, выполните следующие серийные разведения: всем 6 скважин добавить 100 мкл полной DMEM СМИ. Для первой скважины добавьте 100 мкл СМИ без каких-либо вирусом (это ваш безупречный контроль), на второй и добавить 100 мкл разбавленного вируса (что эквивалентно ТО1 мл неразбавленного вируса), к третьей и добавить 100 мклсмеси из второй скважины, на четвертый и добавьте 100 мл с 3-го и, в пятый и добавьте 100 мкл с 4-го хорошо, и к шестому также добавить 100 мкл с 5-го хорошо. Наконец принять 100 мкл из шестого хорошо и выбросить в отбеливатель. Серийного разведения была выполнена хорошо, где каждый имеет половину объема вируса по сравнению с предыдущей. </li><li> Довести общий объем во всех скважинах в 200 мкл. Обратите внимание, что это всего лишь предложил разведения, которые должны хорошо работать для titering наиболее концентрированном вирусов. Если вирус низким титром или неконцентрированных один, возможно, потребуется скорректировать разведений. </li><li> Лечить неиспользованные разбавленный вирус с 10% гипохлоритом натрия в течение 45 минут, прежде чем выбросить в контейнер для биологически опасных отходов. </li><li> Добавить ~ 15000 здоровых, активно делящихся клеток 293, на каждый из 6 скважин. С 96-ю лунками может быть использован для титр 16 вирусных подготавливает. </li><li> Вернуться клетках до 37 градусов инкубаторе с 5% CO 2 и позволяют инфекции проводили в течение по крайней мере 48 часов. </li><li> После инкубации клетки анализируют на репортера выражении (в нашем случае флуоресценции) с потоком цитометр. Вирусные частицы измеряют процент флуоресцентных клеток на лунку. </li></ol> Рассчитайте число инфекционных единиц на мл по следующей формуле: <div style="text-align:center;"> (Кол-во клеток на лунку в день инфекции X репортер положительных клеток) X 1000 ______________________________________________________ мл вектора добавляются также </div> Часть 5: Представитель Результаты: После 48-часовой инкубации трансфекции сообщение периода, пластина из 293 камеры должны быть на уровне около 90% флуоресцентные. Высокий процент флуоресцентные клетки является показателем высокого процента вирусом клеток. После центрифугирования вирусных гранул едва виден, когда ресуспендирования. Это нормально, поскольку гранулы ясна и очень мало. При интерпретации результатов потока цитометр, обратите внимание, что можно достичь только точного расчета титра при заражении (флуоресцентные) клетки получили не более одного вирусного интеграции на ячейку. Для того чтобы обеспечить, что дело обстоит именно так, использовать ячейки с &lt;15% уровень заражения для расчетов. Клетки с более высокой частотой инфекции вероятно, получили множественные вирусные integrants на ячейку. Разведений предложено в шаге 2 должно дать несколько образцов в пределах этого диапазона инфекции. В идеале, используйте несколько образцов для создания титрования участка (линейная линия), из которого можно вычислить окончательные титры, но вы можете рассчитать титр с помощью одного образца, если это необходимо. Можно ожидать, титр 1,0 х 10 7 ТУ / мл в течение не-концентрированного вируса и 1,0 х 10 8 TU / мл концентрированного вируса.

<ol><li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+concentration+of+pseudotyped+HIV-1-based+gene+transfer+vectors.%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.</a> Gene Therapy. , 72-7211 (2000).</li>
<li>Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMEM, клетки HEK 293T, пенициллин-стрептомицин, глутамин, фосфатно-солевой буфер, FBS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Реагент для трансфекции FuGENE 6, pSico mCherry, pMDL, pRSV, pVSVG</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Отбеливатель</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Чашки для культивирования клеток 10 см, 96-луночные планшеты для культивирования клеток</td><td>Falcon BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Многоканальный дозатор</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Фильтрованные наконечники для дозатора</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Пробирки Eppendorf 1.5 мл, шприц, шприцевой фильтр (0.45-&amp;mu;m)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Пробирки для ультрацентрифугирования</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Инкубатор для культур тканей с 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ротор Beckman SW41T.I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ультрацентрифуга Beckman</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Флуоресцентный микроскоп</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Система FACS Array</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Производство лентивирус

Lentivirus Production

РНК-интерференция (RNAi) представляет собой систему генов в живых клетках. В RNAi, гены гомологичные последовательности на короткий вмешательства РНК (миРНК) заставляют молчать в посттранскрипционных государства. Короткие РНК шпилька, предшественники миРНК, могут быть выражены с помощью лентивирус, что позволяет RNAi в различные типы клеток. Лентивирусов, такие как вирус иммунодефицита человека, способны заражать обе деления и не делящихся клеток. Опишем процедуру, которая для упаковки лентивирусов. Упаковка относится к подготовке компетентных вирус из ДНК векторы. Лентивирусов производственных систем вектора основаны на &quot;разбить&quot; система, где естественный вирусный геном был разделен на отдельные вспомогательные плазмиды конструкций. Это расщепление различных вирусных элементов на четыре отдельных векторов уменьшает риск создания репликации вируса, способного придаточных рекомбинации лентивирусов генома. Здесь вектор, содержащий shRNA интересов и три вектора упаковки (р-VSVG, pRSV, pMDL) являются временно трансфекции в человеческий 293 клеток. После по меньшей мере 48-часовой инкубации вируса содержащих супернатант собирают и концентрируют. Наконец, титра вируса определяется репортера (флуоресцентные) выражение потока цитометр.

Для того, чтобы лентивирусов, ДНК векторы трансфекции в человеческий 293 клеток. После сбора урожая и обогатительное супернатант, титра вируса определяется флуоресценции выражение потока цитометр.

РНК-интерференция (РНК-и) представляет собой систему сайленсинга генов в живых клетках. При РНК-интерференции гены, гомологичные по последовательности коротким интерферирующим РНК (кИРНК), ...

Данная процедура начинается с трансфекции клеток 293T лентивирусом, плазмидой и векторами упаковки вируса; супернатант вируса собирают после периода инкубации не менее 48 часов. Супернатант фильтруют, а затем концентрируют с помощью ультрацентрифуги. Вирусный осадок ресуспендируют в PBS для определения титра вируса; сначала концентрированный вирус разводят в полной среде, затем проводят серию разведений для инфицирования клеток лентивирусом.Здравствуйте, меня зовут Шейн Вонг, я работаю в лаборатории Майкла Макмануса в Центре диабета Калифорнийского университета в Сан-Франциско. Я — Майкл Макманус. Сегодня мы продемонстрируем вам методику получения лентивирусов.Мы используем данную процедуру в лаборатории для создания лентивирусов для РНК-интерференции. Итак, приступим. Для начала выполнения данного протокола подготовьте ДНК, которой будут трансфицированы клетки 2 9 3 T.Сначала разведите реагент для трансфекции FU gene six в пробирке объемом 1,5 мл, смешав 30 µL Fuji six с 600 µL бессывороточной среды. Будьте осторожны, чтобы Fuji не касался стенок пробирки при добавлении в среду; инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем в крышке пробирки смешайте 4 µg лентивирусной плазмиды с 1,33 µg.Каждый представляет собой вирусный упаковочный вектор третьего поколения. Лентивирусная плазмида содержит ДНК. Вирус встраивается в геном каждой инфицированной клетки, в то время как упаковочные векторы содержат гены всех остальных белков, необходимых для создания лентивируса; закройте крышку и перемешайте, несколько раз перевернув пробирку.Инкубируйте ДНК и реагент для трансфекции в течение 15–20 минут при комнатной температуре. Теперь переходите к трансфекции клеток 293 подготовленной ДНК; используйте клетки, высеянные за 24 часа до этого и достигшие 50–70% конфлюэнтности. В ламинарном шкафу для культур тканей перенесите всю подготовленную ДНК на планшет с клетками 293. Осторожно перемешайте содержимое, аккуратно наклоняя планшет вперед и назад. Верните клетки в инкубатор и оставьте их для производства вируса на 48–96 часов до момента сбора. Во время инкубации клетки 293 вырабатывают лентивирусы, геномы которых содержат РНК-копию интересующей вас ДНК.Теперь пришло время собрать вирус. Достаньте клетки из инкубатора. В шкафу для работы с культурами тканей подготовьте шприцевой фильтр с порами 0,4 или 5 мкм, одноразовый шприц объемом 10 мл и центрифужную пробирку UltraClear от Beckman.Используйте одноразовый шприц, чтобы удалить супернатант, содержащий вирус. Присоедините к наконечнику шприцевой фильтр с размером пор 0,45 micron и профильтруйте вирус в центрифужную пробирку UltraClear Beckman. Фильтр пропускает только вирусы, задерживая клетки; после этого утилизируйте все клетки, продуцирующие вирус, путем инкубации.Чашки для культивирования, шприцы и фильтры выдерживают в 10% растворе гипохлорита натрия в течение 45 минут. После сбора и фильтрации вируса необходимо провести его концентрирование методом ультрацентрифугирования. Используйте DMEM без сыворотки для выравнивания массы всех пробирок с вирусом с точностью до 0,2 г.Затем поместите сбалансированные центрифужные пробирки в стаканы ротора SW 41 TI или SW 28. Плотно закройте стаканы ротора и закрепите их на роторе. После этого установите ротор в ультрацентрифугу.Центрифугируйте вирус в течение примерно 90 минут при температуре 4 °C со скоростью 25 000 об/мин в роторе SW 41 TI или 24 000 об/мин в роторе SW 28. После центрифугирования вернитесь к ламинарному шкафу для культуры тканей и переверните пробирку, чтобы слить супернатант в контейнер с 10% раствором гипохлорита натрия. Используйте салфетку Kimwipe, чтобы удалить излишки жидкости вокруг осадка, и поместите пробирку в перевернутом виде в подходящий штатив не более чем на пять минут, пока вы не будете готовы ресуспендировать осадок.Для ресуспендирования вирусного осадка с помощью фильтрующего наконечника добавьте в пробирку 100 µL стерильного предварительно отфильтрованного PBS. Затем выполните пипетирование вверх-вниз примерно 20 раз. Оставьте вирус при температуре 4 °C на ночь для полного ресуспендирования.Вирусные препараты можно хранить при температуре 4 °C около одной недели и при -80 °C до одного года. Не забудьте обработать все пустые пробирки 10%-ным раствором гипохлорита натрия перед утилизацией. Если вы планируете использовать вирусный препарат дольше одной недели, его следует хранить в холодильнике.Приготовьте минимальные аликвоты объемом от 5 до 20 µL для будущих экспериментов и одну аликвоту объемом от 3 до 5 µL для определения титра; заморозьте и храните аликвоты при температуре приблизительно -80 °C. Следующим шагом является определение вирусного титра. Если в вашу лентивирусную плазмиду был включен ген флуоресцентного репортера, инфицированные клетки будут флуоресцировать, и вы сможете определить вирусный титр с помощью проточной цитометрии.Для начала разведите три µL концентрированного вируса в 1,5 мл полной среды в лунках с первой по шестую в одном ряду 96-луночного планшета. Выполните следующие серийные разведения во всех шести лунках, используя по 100 µL полной среды DMEM. В первую лунку добавьте 100 µL среды без вируса.Это ваш неокрашенный контроль. Во вторую лунку добавьте 100 µL разведенного вируса. В третью лунку добавьте 100 µL смеси из второй лунки, а затем в четвертую.Добавьте 100 µL из третьей лунки в пятую. Добавьте 100 µL из четвертой лунки в шестую. Добавьте 100 µL из пятой.В завершение из шестой лунки удалите 100 µL и утилизируйте их с использованием отбеливателя; затем доведите общий объем во всех лунках до 200 µL с помощью DMEM. С каждым разведением концентрация вируса уменьшается вдвое. Обратите внимание, что данные разведения являются рекомендуемыми и должны быть эффективны для титрования большинства концентрированных вирусов.Если титр вашего вируса низок или образец не концентрирован, может потребоваться корректировка разведений. Перед утилизацией в контейнер для биоопасных отходов обработайте весь неиспользованный разведенный вирус 10% раствором гипохлорита натрия в течение 45 минут. Добавьте примерно 15 000 здоровых активно делящихся T-клеток 2 9 3 в каждую из шести лунок.Для определения титра 16 вирусных препаратов можно использовать один 96-луночный планшет: доведите объем в лунках до 200 µL, верните клетки в инкубатор и оставьте их для инфицирования минимум на 48 часов. После инкубации проанализируйте флуоресценцию клеток с помощью проточного цитометра. Процент флуоресцентных клеток в каждой лунке можно использовать для определения титра или количества инфекционных вирусных частиц на миллилитр добавленного вируса.При интерпретации результатов проточной цитометрии рассчитайте количество инфекционных единиц на миллилитр по следующей формуле. Обратите внимание, что точный расчет титра возможен только в том случае, если в инфицированные клетки произошло не более одной вирусной интеграции на клетку.Чтобы гарантировать соблюдение этого условия, для расчетов следует использовать клетки с уровнем инфицирования менее 15%. В клетках с более высоким уровнем инфицирования, скорее всего, произошло многократное интегрирование вируса в одну клетку. Разведение, предложенное на втором этапе, должно обеспечить получение нескольких образцов с уровнем инфицирования в этом диапазоне.В идеале следует использовать несколько образцов для построения графика титрования, на основании которого можно рассчитать окончательный титр. Для расчета вирусного титра можно использовать формулу, полученную по аппроксимирующей линейной прямой, однако при необходимости титр можно рассчитать и по одному образцу. Ожидаемый титр для неконцентрированного вируса составляет 1 × 10⁷ трансдуцирующих единиц на миллилитр, а для концентрированного вируса — 1 × 10⁸ трансдуцирующих единиц на миллилитр.Мы только что продемонстрировали вам способ получения лентивирусов при выполнении данной процедуры. Важно соблюдать все правила биобезопасности и надлежащим образом утилизировать отходы. На этом все.Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Лентивирусов векторов экспрессии является наиболее эффективным средством стабильно, выражающих различные эффекторные молекулы или репортер конструкций в разделении и без деления клеток млекопитающих и целые организмы. Здесь мы предоставляем протокол о том, как упаковать lentivector конструкций выражение в pseudoviral частиц и преобразовывать клетки-мишени использованием pseudoviral частиц.

Упаковка с ВИЧ или FIV основе Lentivector Конструкции выражения и трансдукции VSV-G Pseudotyped вирусных частиц

В этом протоколе описываются производства, очистки и титрования лентивирусов векторов. Мы приведем пример того, лентивирусов вектор-опосредованной доставки генов в первичных культивируемых нейронов и астроцитов. Наши методы могут применяться и к другим типам...

Производство лентивирусов векторов для трансдукции клетки из центральной нервной системы

Здесь мы используем ретровирусной трансдукции и concatemeric трансфекции создать клеточную линию, которая может выразить компоненты лентивирусов вектор (LV) в отсутствие тетрациклина. Этот LV кодирующий GFP и pseudotyped с гликопротеином, SVGmu, которая является специфической для рецептором на дендритных клеток.

Тетрациклин-регулируемой клеточная линия продуцирует высоким титром лентивирусных векторов, которые специально направлены дендритных клеток

Здесь мы представляем протоколы, которые предлагают гибкую и стратегическую основу для вирусного манипулирования клетками-предшественниками олигодендроцитов для сверхэкспрессии интересующих белков, чтобы конкретно исследовать их роль в олигодендроцитах с помощью модели миелинизации центральной нервной системы in vitro.

Производство и использование Лентивирус, чтобы выборочно преобразовывать Первичная олигодендроцитов клеток-предшественников для In Vitro миелинизации Анализы

Здесь мы представляем протокол прямого преобразования эмбриональных фибробластов мыши в полностью функциональные и стабильные стволовые клетки трофобласта путем десятидневной сверхэкспрессии Tfap2c, Gata3, Eomes и Ets2.

Протокол для прямого преобразования мышиных эмбриональных фибробластов в трофобласт стволовых клеток

Мы описываем Производственная стратегия интеграза недостаточным лентивирусные векторы (IDLVs) как транспортные средства для доставки ТРИФОСФАТЫ/Cas9 клеток. С возможностью выступить посредником, быстрый и надежный гена редактирования в ячейках IDLVs представляют более безопасным и столь же эффективным вектор платформы для доставки генов по сравнению с интеграза компетентных векторов.

Протокол для производства интеграза недостаточным лентивирусные векторы для ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной нокаут генов в делящихся клетках

Здесь мы представляем протокол для содействия интеграции трансген и основатель трансгенных мышей с высокой эффективности производства путем простой инъекции лентивирусные вектора в пространстве наблюдаться оплодотворенной яйцеклетки.

Лентивирусные опосредованной производства трансгенных мышей: простой и очень эффективный метод для непосредственного изучения учредителей

Целевые epigenome ДНК, редактирования представляет собой мощный терапевтический подход. Этот протокол описывает производства, очищения и концентрации все-в-одном лентивирусные векторы, укрывательство трансген ТРИФОСФАТЫ dCas9-DNMT3A для epigenome редактирование приложений в человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC)-производных нейронов.

Лентивирусные вектор платформа для эффективной доставки Epigenome-инструменты для редактирования в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток болезни моделей

Мы демонстрируем пошаговый протокол исследования функции генов в перитонеальных тканевых резидентных макрофагах in vivo с использованием лентивирусных векторов.

Препарат лентивирусного вектора для эффективной модуляции генов и микроРНК резидентных макрофагов перитонеальной полости in vivo у мышей

Атаксии спиномозжечковых полиглутаминов вызываются экспансиями CAG, производящими белки, склонные к агрегации. Этот протокол описывает производство векторов, стереотаксичную доставку и анализ включений и потери нейронных маркеров, предоставляя контролируемую платформу для изучения механизмов и оценки таргетной терапии нейродегенеративных заболеваний.

Лентивирально-индуцированная стриатальная патология как доклиническая модель полиглутаминной спиномозжечковой атаксии

Здесь мы описываем метод визуализации на основе клеток, субклеточной локализации и количественного анализа обогащённых очагами поли(ADP-рибоза) (PAR) в фиксированных клетках млекопитающих. Этот анализ позволяет количественно определить сайты активации PARP, вызванного повреждением ДНК, включая репарацию удаления основания или восстановление разрыва одной цепоточки, в ядрах клеток, подвергшихся воздействию генотоксина.

Визуализация и количественный анализ активации PARP1/PARP2, индуцированной генотоксином, в клетках с помощью репортера на основе флуоресцентного синтеза белка

Узнайте метод производства лентивирусов с использованием клеток 293T человека. Этот протокол включает трансфекцию, ультрацентрифугирование и определение титра вируса флуоресценцией для генной терапии.

Производство лентивирус

Больше видео