Хромосомные Подготовка распространения человеческих эмбриональных стволовых клеток для Кариотипирование

Введение. Здравствуйте. Мы представляем Институт биометрических наук Федерального университета Жапа (Федеральный университет Файя) в Бразилии. В этом видео мы подготовим препараты метафазных пластинок хромосом эмбриональных стволовых клеток человека для выявления возможных хромосомных перестроек. Хотя было показано, что эмбриональные стволовые клетки человека обладают стабильным развернутым кариотипом, в многочисленных исследованиях сообщалось, что в зависимости от условий культивирования они становятся склонными к приобретению хромосомных аномалий, таких как прикрепление целых хромосом или их частей.

Характеристика генетической целостности HASS in vitro имеет решающее значение, поскольку она является важной частью исследований эмбриогенеза и тестирования лекарственных препаратов. Кроме того, при разработке будущих методов терапии серьезную обеспокоенность вызывают хромосомные изменения, так как они часто связаны с канцерогенезом. Итак, приступим.

Обработка клеток ATE. В данной процедуре мы используем этот метод. Клетки культивировали в среде F 12 с добавлением 20% заменителя сыворотки без компонентов животного происхождения и 8-9 нг/мл фактора роста фибробластов. Начните с того, что извлеките культуральный флакон из инкубатора и, находясь под ламинарным потоком воздуха, добавьте койт до конечной концентрации 0,1 мкг/мл.

Добавление Coit в среду индуцирует митоз, покой и метафазу. Когда хромосомы достаточно конденсируются и их становится легче визуализировать под микроскопом, обязательно используйте стерильные методы, чтобы избежать контаминации. После добавления Coit закройте колбу и верните клетки в инкубатор.

Фиксация клеток после периода инкубации: на данном этапе клетки еще не готовы к фиксации. Работа в стерильных условиях не требуется. Начните с аспирации среды, после чего добавьте трипсин.

Добавьте 0,05% DTA в колбу. Убедитесь, что добавлено достаточное количество трипсина, чтобы покрыть всю поверхность дна с клетками. Закройте колбу крышкой и осторожно покачайте ее для равномерного распределения.

После добавления трипсина инкубируйте клетки в течение пяти минут при комнатной температуре. По истечении пяти минут инкубации при комнатной температуре клетки должны открепиться от дна флакона; после этого необходимо инактивировать трипсин, добавив питательную среду с сывороткой или осторожно добавив сыворотку к клеткам. Осторожно снимите крышку флакона и добавьте питательную среду или сыворотку так, чтобы жидкость стекла по стенке на дно флакона к клеткам.

Несколько раз пропипетируйте клеточную суспензию вверх-вниз для полной диссоциации клеток. Перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, предварительно убедившись, что клетки полностью диссоциированы и в суспензии отсутствуют видимые скопления клеток. После завершения переноса закройте пробирку крышкой и центрифугируйте.

Перемешивайте суспензию в течение пяти минут. После центрифугирования при 800 RPM на дне пробирки должен образоваться осадок клеток. Будьте осторожны, чтобы не потревожить клеточный осадок.

Отоберите супернатант с помощью дозатора P 1000 до тех пор, пока не останется примерно 200 microliters. Этот объем является средним для суспендирования. Ресуспендируйте осадок.

Ресуспендируйте осадок. Осторожно постучите по пробирке пальцами несколько раз. Убедитесь, что клетки полностью суспендированы, проверив отсутствие клеточных агрегатов в растворе.

На данном этапе раствор должен стать мутным. Затем необходимо добавить пять миллилитров 75 мМ раствора хлорида калия, предварительно нагретого до 37 °C. Гипотонический раствор следует добавлять очень медленно, направляя струю по стенке пробирки при одновременном ее вращении.

После добавления первых трех миллилитров плотно и осторожно закройте пробирку крышкой. Гомогенизируйте клеточную суспензию с гипотоническим раствором, медленно вращая пробирку по горизонтали.

Далее медленно добавьте оставшиеся два миллилитра таким же образом, как и прежде. Цель использования гипотонического раствора заключается в увеличении объема клеток, чтобы хромосомы могли распутаться. Таким образом, этот период инкубации имеет решающее значение для получения качественных препаратов хромосомных наборов. После добавления всех пяти миллилитров закройте пробирку крышкой и инкубируйте клетки на водяной бане при температуре 37 °C в течение 15 минут.

По истечении 15 минут инкубации извлеките пробирку из водяной бани. На этом этапе рекомендуется работать в вытяжном шкафу, так как пары фиксирующего раствора токсичны. Если вытяжной шкаф недоступен, обязательно работайте в хорошо проветриваемом помещении.

Снимите колпачок с пробирки и добавьте три капли фиксирующего раствора. Данный раствор представляет собой смесь метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1 и должен быть приготовлен в день использования. Плотно закройте пробирку колпачком и осторожно перемешайте содержимое, медленно вращая пробирку горизонтально: сначала по часовой стрелке, затем против часовой стрелки.

Центрифугируйте пробирку в течение пяти минут при 800 RPM без торможения. Очень важно, чтобы цикл центрифугирования завершался медленно, чтобы предотвратить потерю материала вследствие разрушения клеток после центрифугирования. Этот супернатант находится в объеме около 200.

Чтобы суспендировать осадок, несколько раз осторожно щелкните по пробирке пальцами. Убедитесь, что клетки были хорошо суспендированы, проверив отсутствие оставшихся скоплений клеток. Медленно добавьте 3 mL фиксирующего раствора по стенке пробирки, вращая ее после добавления первых трех миллилитров.

Плотно закройте пробирку T крышкой и осторожно гомогенизируйте клеточную суспензию, медленно вращая пробирку горизонтально. Обязательно сделайте как минимум один полный оборот. Для максимальной эффективности процесса перемешивания повторите процедуру.

Добавьте два миллилитра фиксирующего раствора вдоль стенки пробирки, чтобы осадить клетки. Храните клеточную суспензию при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. Эти фиксированные клетки могут храниться в фиксирующем растворе при температуре четыре градуса Цельсия в течение нескольких месяцев.

На следующий день промойте клетки, центрифугируя их в течение пяти минут при 800 RP без перерыва. Удалите супернатант и оставьте около 200 µL. Ресуспендируйте осадок, несколько раз слегка постучав по пробирке пальцами.

Убедитесь, что клетки хорошо ресуспендированы и в суспензии нет видимых скоплений клеток. Медленно добавьте пять миллилитров свежего фиксирующего раствора по стенке пробирки. Закройте пробирку крышкой и гомогенизируйте клетки, осторожно наклоняя пробирку горизонтально и медленно вращая ее.

Помимо защиты клеток, фиксирующий раствор удаляет липиды, а затем осаждает белки, что в результате облегчает распространение хромосом. Центрифугируйте пробирку в течение пяти минут при 800 RRP M без перерыва. Подготовка предметных стекол: на этапе центрифугирования оставьте достаточное количество раствора для гомогенизации клеточного осадка.

Данный объем жидкости может зависеть от количества клеток. Несколько раз аккуратно постучите по пробирке пальцами. Убедитесь в полной гомогенизации суспензии, проверив отсутствие видимых клеточных агрегатов.

На данном этапе необходимо добавить от 20 до 30 µL клеточной суспензии на чистый сухой предметное стекло, перемещая пипетку параллельно поверхности стекла. По мере испарения фиксирующего раствора поверхность стекла мгновенно становится зернистой. Подвергните воздействию струи горячего пара в течение 30 секунд, чтобы вызвать расширение клеток.

Анализ образцов. После подготовки этих предметных стекол проанализируйте их под фазово-контрастным микроскопом с использованием объективов 10х и 40х, чтобы определить, подходит ли плотность клеток для дальнейшего анализа. Данное стекло является примером слишком высокой концентрации.

Обратите внимание, что ядра клеток расположены слишком близко к метафазным пластинкам. Если на предметном стекле плотность клеток слишком высока, разбавьте суспензию клеток, добавив больше фиксирующего раствора. На данном стекле представлена желаемая плотность клеток.

Обратите внимание, что метафазные пластинки хорошо разобщены и изолированы. После получения препарата с оптимальной плотностью клеток его можно окрасить и проанализировать. Избегайте выбора метафаз, расположенных рядом с ядром, так как хромосомы могут быть скрыты или перекрыты.

Ищите метафазы округлой формы, при этом убедитесь, что хромосомы не отклоняются от метафазной пластинки; выбирайте округлые и хорошо изолированные метафазы. Как показано на следующем слайде, старайтесь избегать ложных результатов IES, таких как увеличение числа хромосом из-за перекрытия двух и более препаратов или потеря хромосом из-за наличия вытянутых хромосом.

Мы надеемся, что данное видео поможет вам в проведении дальнейших экспериментов. Если у вас возникнут какие-либо вопросы, пожалуйста, свяжитесь с нами. Желаем вам успехов в работе.