Использование протеазы Флуоресцентный Kit обнаружения для определения протеазы активность

Данный протокол начинается с добавления инкубационного буфера, раствора казеина FXI и образца, содержащего исследуемую протеазу, в микроцентрифужную пробирку, после чего смесь осторожно перемешивают и инкубируют при 37 °C в течение 60 минут в темноте. Чтобы остановить протеолитическую реакцию по окончании периода инкубации, добавляют раствор TCA, осторожно перемешивают и снова инкубируют при 37 °C в течение 30 минут в темноте. На этом этапе произойдет осаждение не вступившего в реакцию субстрата.

Центрифугируйте образец в течение 10 минут при 10, 000 Gs. Удалите супернатант, содержащий кислоторастворимые меченые фрагменты FXI. Перенесите супернатант в кювету или многолуночный планшет, разбавьте аналитическим буфером и измерьте образец на флуориметре.

Здравствуйте, меня зовут Кэрри Кап Вайнярд, я ученый в центре Sigma Aldridge DeKalb в Сент-Луисе, штат Миссури. Сегодня я продемонстрирую вам процедуру флуориметрического определения протеазной активности. Мы используем этот метод в нашей лаборатории контроля качества для определения низкой активности протеаз.

Приступим к работе. Для данной процедуры буфер для инкубации, анализ-буфер и 0,6 н. раствор трихлоруксусной кислоты (TCA) предоставляются в виде готовых к использованию растворов. Расположите раствор fite с маркировкой Cain по аликвотам меньшего объема и храните при температуре -20 °C. Обязательно обеспечьте защиту от света, используя флаконы из янтарного стекла или обернув прозрачные пробирки фольгой.

Использование субстрата Phycocyanin сводит к минимуму необходимость в повторных циклах замораживания-оттаивания; повторные циклы замораживания-оттаивания, интенсивное встряхивание или перемешивание Phycocyanin могут привести к отделению фикобилисом от протеинов, что приведет к повышению фонового сигнала. При калибровке флуориметра или определении линейного диапазона сигнала Phycocyanin приготовьте контрольный раствор Phycocyanin. Приготовьте свежий раствор, восстановив его в аналитическом буфере до соответствующей концентрации.

Когда раствор будет готов, защитите его от света. В завершение подготовьте контрольный образец протеазы трипсина, добавив 100 µL 1 mM соляной кислоты в флакон с лиофилизированным трипсином, и кратковременно перемешайте для полного растворения трипсина. Хранение трипсина в кислых условиях повышает его стабильность.

Обратите внимание, что контрольный раствор трипсина чувствителен к температуре и нестабилен при низких концентрациях. Затем приступите к подготовке всех образцов для анализа, включая исследуемые образцы, а также контрольные и холостые пробы, используемые на протяжении всего анализа. Все исследуемые образцы следует хранить в защищенном от света месте.

Смешайте в микроцентрифужной пробирке 20 µL инкубационного буфера, 20 µL субстрата fit c kian и 10 µL исследуемого образца. Можно использовать прозрачную микроцентрифужную пробирку, при условии, что инкубация образца проводится в темноте. Также следует отметить, что образцы с высокой протеазной активностью потребуют разведения.

Контрольный образец трипсина используется в качестве положительного контроля для проверки правильности проведения анализа, определения предела обнаружения или построения общей стандартной кривой. Для приготовления контрольного образца трипсина смешайте одну часть подкисленного трипсина с девятью частями инкубационного буфера или буфера, используемого для тестовых образцов, и тщательно перемешайте. Конечная рабочая концентрация трипсина составляет 20 µg/mL. При использовании другой специфической протеазы приготовьте контрольный раствор с этой протеазой и соответствующим буфером.

Продолжите подготовку контрольного образца, смешав в микроцентрифужной пробирке 20 µL инкубационного буфера, 20 µL субстрата fz cain и 10 µL контрольного раствора трипсина. Рекомендуется проводить анализ как минимум одного контрольного образца с содержанием трипсина 5 ng при каждом определении или использовать метод серийных разведений. Последним образцом является холостая проба, которую готовят, смешав в микроцентрифужной пробирке 20 µL инкубационного буфера, 20 µL субстрата Fitz Caine и 10 µL ультрачистой воды.

Подготовив три типа образцов, осторожно перемешайте содержимое каждой пробирки и инкубируйте при 37 °C в темноте в течение 60 минут. Избегайте слишком интенсивного перемешивания, так как чрезмерная турбулентность может привести к высокому фоновому уровню флуоресценции и снизить чувствительность анализа. Для повышения чувствительности время инкубации можно увеличить до 24 часов, однако более длительная инкубация не рекомендуется, так как казеин FXI может начать деградировать.

Чтобы избежать высокого уровня фоновой флуоресценции по окончании инкубации, используя соответствующие средства индивидуальной защиты, добавьте по 150 µL раствора ТХС в каждую микроцентрифужную пробирку. После инкубации с ТХС в пробирке должна появиться белая муть, представляющая собой осажденный, непереваренный и нерастворимый казеин; осторожно перемешайте и инкубируйте при 37 °C в темноте в течение 30 минут. По завершении инкубации с раствором ТХС центрифугируйте пробирки в течение 10 минут при 10 000 ×g при комнатной температуре.

Надстрой contains кислоторастворимые фрагменты fite, меченные Cain, которые используются для измерения флуоресценции. Осторожно отберите жидкость с верхней части пробирки, чтобы осадок не попал в наконечник пипетки, так как это приведет к ложноположительному результату при последующем флуоресцентном детектировании. Для измерения активности протеазы с помощью флуориметра смешайте в пробирке 10 µL супернатанта TCA с 1 mL assay buffer и аккуратно перемешайте. Кроме того, разведите стандарт FE для анализа, добавив 10 µL FE в 1 mL assay buffer. Контроль FE и стандарт Tripsin обеспечивают уровень флуоресценции, который не должен превышаться в образце. Раствор супернатанта TCA и assay buffer можно хранить в темноте при температуре от 2 до 8 °C до 24 часов перед измерением флуоресценции.

При измерении с помощью кюветы перенесите 1 mL раствора в подходящую кювету; если необходимо проанализировать большое количество образцов, для получения флуориметрических данных можно использовать 96-луночный планшет и флуориметрический планшетный ридер. В данном анализе флуоресцеинизотиоцианат используется в качестве контроля для возможной калибровки прибора. Здесь представлен репрезентативный диапазон линейности сигнала FS e после выполнения описанной процедуры.

Использование данного набора с временем инкубации 30 минут на первом этапе инкубации позволяет получить типичную стандартную кривую для трипсина и контрольных образцов в диапазоне от 1.5 nanograms до 25 nanograms. Измерения флуоресценции проводились в многолуночном планшете. Пределом обнаружения анализа является количество протеазы, которое вызывает значимое отклонение показателя флуоресценции в сторону увеличения по сравнению со значением, полученным для холостого образца.

Сегодня мы продемонстрировали, как использовать набор для определения протеаз Sigma Aldridge для обнаружения флуориметрической протеазной активности в биологическом образце. Несмотря на то, что данный набор оптимизирован для использования, важно помнить, что для конкретных протеаз могут потребоваться небольшие модификации. На этом все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.