Подготовка Объединенные тромбоцитов человека лизат (pHPL) как эффективное дополнение для животных бессывороточной человеческих культур стволовых клеток
30 октября 2009 г.
Человек тромбоцитов лизат является богатым источником факторов роста и мощным дополнением в клеточной культуре. Этот протокол представляет процесс подготовки большого пула тромбоцитов человека лизат, исходя из богатой тромбоцитами плазмы, выполняя несколько циклов замораживания-оттаивания и истощению тромбоцитов фрагментов.
В данном протоколе представлен процесс подготовки большого объема пула лизата тромбоцитов человека, начиная с тромбоцитарно-обогащенной плазмы. Путем проведения одного цикла замораживания-оттаивания тромбоциты подвергаются лизису. Затем не менее 10 единиц лизата тромбоцитов человека объединяются в одну партию пула лизата тромбоцитов человека или PHPL.
Данный объем объемом около трех литров далее разделяют на аликвоты и повторно замораживают для удаления фрагментов тромбоцитов. Эти аликвоты размораживают, переносят в пробирки и центрифугируют. Супернатант представляет собой PHPL, обедненный фрагментами тромбоцитов и содержащий факторы роста тромбоцитарного происхождения, который используется для дополнения клеточных культур.
Оставшийся осадок фрагментов тромбоцитов удаляют. Здравствуйте, я Кадина Шармо из лаборатории доктора TRO в отделе исследований стволовых клеток Медицинского университета Градс. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру подготовки пула изолятов тромбоцитов человека.
Мы начнем с получения обогащенной тромбоцитами плазмы, проведем несколько циклов замораживания-оттаивания, а затем удалим фрагменты тромбоцитов. В нашей лаборатории мы используем эту процедуру для получения достаточного количества добавки для клеточных культур в качестве альтернативы фетальной бычьей сыворотке. Итак, приступим.
Данный протокол начинается с использования обогащенной тромбоцитами плазмы, называемой PRP. Эта плазма может быть получена методом лейкафереза или из слоя лейкоцитов (buffy coat). Специалистам, не работающим в области трансфузиологии, рекомендуется приобретать PRP в местном банке крови или у другого авторизованного поставщика.
Проверьте стерильность единицы PRP, перенеся 20 milliliters из каждой единицы в небольшой соединенный пакет, после чего отсоедините пакет с помощью сварочного аппарата. Эту аликвоту можно отправить в микробиологическую лабораторию для тестирования на стерильность сразу после приготовления. Важно заморозить единицы PRP при температуре не выше −20 °C в исходном пакете для хранения.
После получения отрицательных результатов бактериологических тестов можно приступать к следующему этапу. Следя за тем, чтобы лизат тромбоцитов человека, далее именуемый HPL, не перегрелся, поместите единицы HPL в водяную баню при 37 °C до полного исчезновения ледяных сгустков. После этого этапа замораживания-оттаивания следует провести лизис тромбоцитов для подготовки стандартизированного продукта для каждого пула лизата тромбоцитов.
Соберите от 10 до 15 размороженных единиц PRP. Подсоедините каждый последующий пакет HPL к двойному пакету для объединения, затем перенесите HPL в эти два пакета. Отсоедините пустые пакеты HPL с помощью сварочного аппарата.
Смешайте содержимое двух пакетов, чтобы получить конечный объем от трех до четырех литров объединенного лизата тромбоцитов человека. Далее этот продукт именуется PHPL. Подсоедините небольшой пакет и отберите пробу PHPL объемом 20 milliliter для проверки стерильности объединенного продукта.
Разделите образцы PHPL на аликвоты для последующей обработки, подсоединив небольшие пакеты к общему двойному пакету. Перенесите объемы примерно 250 milliliters в малые пакеты для хранения, после чего отсоедините заполненные пакеты с помощью запаивающего устройства. Затем проведите дополнительный цикл замораживания-оттаивания, чтобы увеличить степень фрагментации тромбоцитов и количество высвобожденных факторов роста.
Для этого заморозьте небольшие пакеты с порционным PHBL при температуре -20 °C. Затем разморозьте пакеты на водяной бане при 37 °C в ламинарном шкафу.
С помощью стерильных ножниц разрежьте и откройте трубку каждого пакета, затем перелейте PHPL в флаконы объемом 50 milliliter. Фрагменты тромбоцитов часто имеют тенденцию к агрегации и также могут вызвать аллоиммунизацию. Чтобы избежать этих условий, удалите фрагменты из PHPL путем центрифугирования при 4, 000 GS в течение 15 минут в охлаждаемой центрифуге.
Затем перенесите супернатант плазмы пипеткой в конечные пробирки для хранения и удалите осадок тромбоцитов, чтобы избежать попадания их фрагментов в клеточные культуры. Заморозьте аликвоты PHPL по 50 milliliter снова при температуре minus 20 degrees до дальнейшего использования. После получения PHPL, обедненного фрагментами тромбоцитов, можно приступить к анализу характеристик лизата.
Функция и качество объединенного лизата тромбоцитов проверяются в клеточных культурах и подтверждаются эффективной стимуляцией пролиферации клеток, успешным размножением мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и эндотелиальных колониеобразующих клеток (ЭКОК) с использованием PHPL, обедненного фрагментами тромбоцитов. Рецепты сред представлены в нашем письменном протоколе по этой ссылке. Два варианта применения объединенного лизата тромбоцитов человека.
На культуре мезенхимальных стромальных клеток показаны МСК от первого донора, которые культивировали либо с PHPL, либо с PHPL, обедненным фрагментами тромбоцитов. Как видно, здесь наблюдается большее загрязнение фрагментами по сравнению с использованием только PHPL, обедненного фрагментами. Фрагменты тромбоцитов недостаточно поддерживают рост МСК.
Все три изображения были получены после 13 дней культивирования. МСК от второго донора культивировали в течение девяти дней в PHPL, обедненном фрагментами тромбоцитов, а не в богатой тромбоцитами плазме. Обратите внимание, что PRP без лизиса тромбоцитов недостаточно поддерживает рост МСК.
Также ознакомьтесь с протоколом JoVE от Андреаса Райша, в котором описывается использование PHPL, обедненного фрагментами, для выделения и культивирования МСК, полученных из пуповинной крови человека. Мы только что продемонстрировали вам, как приготовить PHPL для полной замены сыворотки животных в ваших культурах стволовых клеток. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости удаления фрагментов тромбоцитов перед добавлением гепарина и PHPL в питательную среду.
На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе подробно описан процесс приготовления лизата тромбоцитов человека (HPL) из обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP). Процесс включает циклы замораживания-оттаивания для лизиса тромбоцитов и получения лизата с низким содержанием фрагментов тромбоцитов, обогащенного факторами роста для использования в качестве добавок к культуральным средам.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Культура клеток
- Биология тромбоцитов
- Исследование факторов роста
Теоретические сведения
- Лизат тромбоцитов человека является эффективной добавкой для культивирования клеток.
- Он содержит различные факторы роста, необходимые для пролиферации и дифференцировки клеток.
- Процесс приготовления имеет решающее значение для обеспечения качества и эффективности лизата.
- В качестве исходного материала для приготовления HPL используется обогащенная тромбоцитами плазма.
Цель исследования
- Предоставить детальный протокол приготовления лизата тромбоцитов человека.
- Обеспечить удаление фрагментов тромбоцитов для получения более чистого лизата.
- Способствовать применению HPL в различных задачах культивирования клеток.
Используемые методы
- Использование богатой тромбоцитами плазмы (PRP) в качестве исходного материала.
- Проведение циклов замораживания-оттаивания для лизиса тромбоцитов.
- Приготовление пулированного лизата тромбоцитов человека (PHPL).
- Центрифугирование для удаления фрагментов тромбоцитов из супернатанта.
Основные результаты
- Успешное получение большого объема лизата тромбоцитов человека.
- Удаление фрагментов тромбоцитов с помощью центрифугирования.
- Выход примерно трех литров факторов роста, полученных из тромбоцитов.
- Препарат, пригодный для использования в качестве добавки в клеточные культуры.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод приготовления лизата тромбоцитов человека.
- Лизат тромбоцитов человека может значительно улучшить результаты культивирования клеток.
- В дальнейших исследованиях можно изучить применение лизата тромбоцитов человека в различных областях науки.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Системы культивирования без использования сыворотки животных имеют решающее значение для продвижения терапии стволовыми клетками в сторону клинического внедрения и соблюдения нормативных требований. Данный протокол позволяет осуществлять масштабируемое производство лизата тромбоцитов человека (pHPL) в качестве определенной, ксено-свободной добавки, которая поддерживает пролиферацию мезенхимальных стромальных клеток и размножение эндотелиальных колониеобразующих клеток. Благодаря стандартизации лизиса тромбоцитов и удаления фрагментов, этот метод снижает вариабельность между партиями и повышает воспроизводимость в рабочих процессах раннего поиска и доклинических исследований.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает использование определенной добавки человеческого происхождения, которая поддерживает механистические исследования путей пролиферации и дифференцировки стволовых клеток.
- Практическая ценность: позволяет поддерживать стабильные условия культивирования в различных экспериментах, снижая вариабельность в анализах по валидации мишеней.
Скрининг и разработка метода анализа
- Научная ценность: Обеспечивает использование стандартизированной среды, богатой факторами роста, что гарантирует достоверность результатов в функциональных анализах стволовых клеток.
- Практическая ценность: Способствует стандартизации анализа за счет использования лизата, обедненного фрагментами, что сводит к минимуму влияние агрегатов тромбоцитов в скрининговых платформах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает экспансию стволовых клеток, имеющих значение для изучения заболеваний, в условиях отсутствия ксеногенных компонентов, что соответствует требованиям к трансляционным биомаркерам и доклиническим моделям.
- Практическая ценность: Позволяет осуществлять масштабируемое производство из объединенных донорских источников, что способствует трансферу технологий и разработке процессов, приближенных к стандартам GMP.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс поиска новых терапевтических мишеней, обеспечивая использование безсывороточной добавки для культивирования стволовых клеток на всех этапах — от ранней валидации мишени до доклинического масштабирования, что способствует идентификации перспективных соединений и снижению рисков за счет изучения механизмов действия.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о пролиферации и дифференцировке стволовых клеток за счет создания стабильного, определенного микроокружения.
- Скрининг: позволяет проводить воспроизводимое тестирование соединений или условий в анализах на основе стволовых клеток с использованием стандартизированного лизата, очищенного от фрагментов.
- Аналитика: обеспечивает получение количественных данных, таких как скорость пролиферации клеток и эффективность колониеобразующих единиц, что позволяет проводить сравнительный анализ различных условий культивирования.
- Трансляционные исследования: связывают фундаментальные открытия с доклиническими работами, обеспечивая экспансию мезенхимальных стромальных и эндотелиальных прогениторных клеток в клинически значимых условиях без использования компонентов животного происхождения.
- Промышленное применение: устанавливает воспроизводимый и масштабируемый процесс получения добавки клинического класса из рутинно получаемой богатой тромбоцитами плазмы, снижая зависимость от вариабельных сывороток животных.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования результатов культивирования стволовых клеток за счет исключения неопределенных компонентов сыворотки животных и стандартизации доставки факторов роста.
- Операционная ценность: Улучшает воспроизводимость и масштабируемость благодаря использованию пулированного материала доноров, а также стандартизированным этапам замораживания-оттаивания и центрифугирования.
- Стратегическая ценность: Снижает биологические риски при разработке клеточной терапии, предоставляя альтернативу фетальной бычьей сыворотке на основе материалов человеческого происхождения, не содержащих ксеногенных компонентов.
- Влияние на портфель: Поддерживает принятие взвешенных с учетом рисков решений о дальнейшем продвижении за счет обеспечения стабильного получения доклинических данных в определенных системах культивирования.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы в условиях стерильного культивирования клеток, опыт обращения с тромбоцитами и знание протоколов центрифугирования.
- Необходим доступ к богатой тромбоцитами плазме из авторизованных банков крови или служб переливания, а также стерильное оборудование для сварки или герметизации пакетов при проведении манипуляций.
- Требуется стандартизированный контроль стерильности исходной PRP и объединенного лизата до и после обработки для обеспечения безопасности культуры.
- Необходима адаптация протоколов культивирования с учетом вариаций концентрации факторов роста в разных партиях, несмотря на стратегию объединения образцов.
- Процесс ограничен необходимостью проведения многократных циклов замораживания-оттаивания и этапов центрифугирования, что увеличивает время обработки и требует специализированного оборудования.
