Выделение и животных Сыворотка свободного расширения прав пуповины производных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и эндотелиальных колонии Формирование клеток-предшественников (ECFCs)

Этот протокол описывает изоляцию и последующее расширение мезенхимальных стромальных клеток и эндотелиальных клеток, образующих колонии без использования животного сыворотку для получения аутологичных пар в экспериментальных целях трансплантации.

Пуповина человека является легкодоступным источником клеток-предшественников. В данной статье мы описываем протокол выделения и последующей экспансии эндотелиальных предшественников и ХФУ, субпопуляции клеток внутри стенки сосуда и мезенхимальных клеток-предшественников. МСК происходят из одной пуповины человека.

Сначала с помощью ножниц продольно надрезают вдоль пупочной вены человека и соскабливают клетки с внутренней поверхности сосуда. Переложите ячейки из скребка в колбу и дождитесь разрастания колонии. Некоторые из соскобленных клеток будут проявлять фенотип предшественника и будут сильно размножаться, образуя большие колонии.

Как только эти клетки размножаются, электронные ХФУ могут быть увеличены в новых колбах. Для дальнейшего анализа популяция мезенхимальных клеток также может быть выделена из пуповины человека. Нарежьте части шнура на мелкие кусочки и перенесите их на стерильную тарелку для культуры.

Через несколько дней вокруг кусочков ткани межсосудистого канатика будет видно вырастание стромальных клеток. Перенесите эти ячейки в новые колбы и разверните их для дальнейшего анализа. Этот протокол позволяет получить два типа линий клеток-предшественников из одного шнура исходного материала в течение трех-четырех недель.

Здравствуйте, я Андреас Даниш из лаборатории доктора Т. Стронга в исследовательском подразделении стволовых клеток в Медицинском университете Града в Австрии. Сегодня мы покажем вам процедуру выделения, расширения и анализа клеток мезенхимального и эндотелиального каналов человека из одного кода пуповины. Только одно замечание о терминологии.

Наши клетки называются мультипотентными, мезенхимальными стромальными клетками, или МСС, и эндотелиальными профоклетами, образующими толстую кишку, или э ЦСК. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения функции и биологии негематических клеток-предшественников. Итак, приступим.

Перед этапами выделения клеток протрите кожух для культуры тканей ламинарного потока инадином и соберите стерильные планшеты для клеточных культур. Колбы для клеточных культур, стерилизованные хирургические инструменты PBS, скребки для клеток, держатель пробирки, 25-миллилитровые стрип-петы и пятимиллилитровый шприц с тупым концом иглы. Не забудьте предварительно подогреть среду для двух клеточных культур альфа-MEM и EGM на водяной бане при температуре 37 градусов.

Теперь перенесите пуповину в ламинарный поток и дважды промойте ее в PBS. Чтобы удалить загрязняющую кровь, используйте стерильный пятимиллилитровый шприц, чтобы канюлировать вену пуповины с одной стороны. Теперь промойте пупочную вену PBS до тех пор, пока жидкость не вытечет.

Другой конец шнура становится полностью прозрачным без красного оттенка. Начните выделение эндотелиальных колоний, образующих клетки-предшественники, наполнив колбу площадью 75 квадратных сантиметров от 15 до 20 миллилитров предварительно теплой среды EGM two. Поместите шнур в новую пластину, наполненную стерильным PBS, и с помощью хирургических ножниц разрежьте шнур на две части, каждая длиной около пяти сантиметров.

Теперь вставьте одно лезвие хирургических ножниц и разрежьте вену в продольном направлении. На этом этапе ассистент может использовать щипцы для удержания вены, пока делаются дальнейшие надрезы. Поместите шнур с открытой веной в новую пластину.

Без PBS используйте скребок для клеток, чтобы втереть внутреннюю поверхность вены на площади не менее одного сантиметра. Промойте скребок в среде EGM two до выпуска протертых сосудов ячеек в колбу. Эту процедуру нужно будет повторять до 10 раз.

Закройте колбу и поместите ее в инкубатор, установленный при температуре 37 градусов, 5% углекислого газа и влажности 95%. Теперь, когда ХФУ были выделены, давайте перейдем к МСК. Теперь, когда эндотелиальный слой соскоблен, с помощью стерильного скальпеля разрежьте канатик на очень мелкие кусочки.

Один-два миллиметра. Максимум используйте стерильные щипцы для переноса этих кусочков в предварительно маркированную культуральную тарелку. Оставьте тарелку открытой не менее чем на пять минут, прежде чем наполнить ее средой, чтобы кусочки прилипли к пластиковой поверхности.

Используя как можно более низкую скорость, аккуратно добавьте от 30 до 35 миллилитров предварительно подогретого альфа-модифицированного MEM. Закройте тарелку и поместите ее в инкубатор, установленный при температуре 37 градусов с 5% углекислым газом и влажностью 95%. Вырастание мезенхимальных стромальных клеток из кусочков канатика занимает от трех до семи дней, после чего клетки могут быть расширены.

Между тем, ECFC можно расширить, что вы увидите на следующем шаге. На следующий день используйте инвертированный микроскоп для осмотра клеток. Если процедура выскабливания была проведена правильно, первые пролиферирующие клеточные кластеры будут видны полностью.

Замените E GM две среды, чтобы удалить все неприкрепленные клетки и частицы. Продолжайте расширять клетки и заменять треть среды два раза в неделю. Через 10-12 дней регулярно наблюдаются очень большие эндотелиальные колонии.

Теперь удалите среду и промойте PBS, чтобы избавиться от остатков белка. 0,05% трипсин, 0,7 миллимоляра ЭДТА для отделения клеток. При переносе клеток в новые культуральные сосуды обязательно выбирайте колбы соответствующего размера, чтобы добиться низкой плотности затравки.

Это поможет дальнейшему расширению. Наша лаборатория обычно отсаживает потомство из более чем 20 больших колоний в четыре колбы площадью двести двадцать пять квадратных сантиметров. Не забывайте заменять одну треть среды два раза в неделю.

Аналогичный протокол используется для расширения MSC в следующем разделе. По прошествии трех-семи дней используйте инвертированный микроскоп, чтобы проверить наличие веретенообразных клеток рядом с прикрепленной тканью. Когда происходит достаточный разрастание клеток, кусочки имеют тенденцию прикрепляться, теряя контакт с пластиком.

Через 10-12 дней удалите кусочки ткани. Отделите МСК от пластика с помощью раствора трипсина ЭДТА и перенесите клетки в колбы с культурой новой среды, которые имеют соответствующий размер и количество, гарантирующие низкую плотность посева во время расширения клеток. Необходимо будет заменять одну треть среды два раза в неделю после того, как оба типа клеток будут расширены.

Окрашивание с последующей проточной цитометрией может быть выполнено для обнаружения экспрессии маркеров клеточной поверхности, указывающих на фенотипы предшественников, и определения отсутствия контаминации гемопоэтическими клетками. Засейте чистые собранные электронные ХФУ при очень низкой плотности покрытия в 3 или 10 клеток на квадратный сантиметр в клеточных культуральных планшетах, чтобы гарантировать обмен одной колонии на одну треть среды, два раза в неделю через 14 дней. Конец культуры.

Удалите среду. Дважды вымойте PBS и зафиксируйте колонии ледяным раствором фиксации На 15 минут в холодильнике выбросьте раствор фиксации и оставьте пластины открытыми для высыхания на 10 минут. Регидратируйте клетки дистиллированной водой в течение 10 минут.

Добавьте раствор гематина Harris и окрашивайте неподвижные колонии на 12 минут. Удалите раствор гематина и промойте пластины водопроводной водой. Для избавления от остатков окрашивающего раствора.

Сфотографируйте каждую колонию с помощью стереомикроскопа и импортируйте файлы в формате jpeg или TIFF на свой компьютер. Откройте фотографии с помощью программного обеспечения image J и проанализируйте точное количество клеток каждой колонии, как описано на следующей анимации. Откройте программу image J и импортируйте изображение колонии с помощью функции открытия файла в выпадающем меню.

Продолжайте использовать процесс. Функция вычитания фона. Используйте функцию выбора эллиптической формы или кисти в меню J изображения, чтобы отметить колонийное поле.

Очистите окружающее изображение с помощью функции редактирования очистить снаружи и обрежьте изображение, выбрав обрезку изображения. Настройте порог вручную с помощью функции настройки порога изображения, чтобы все ячейки были полностью закрашены. Красный. Посчитайте номер ячейки колонии путем выбора.

Анализируйте, анализируйте частицы. Выберите подходящие настройки, оптимизированные для каждого типа ячеек, и нажмите кнопку ОК, если все выполнено правильно. Этот протокол позволяет выделить практически чистую популяцию клеток, которые имеют общие характеристики эндотелиальных и мезенхимальных клеток-предшественников человека, которые являются аутологичными друг другу, поскольку происходят из одного и того же каната.

Начиная с пятого дня, веретенообразные мезенхимальные клетки будут появляться снизу от куска шнура, прикрепленного к культуральной пластине. Через один-два дня первые кластеры эндотелиальных колоний-предшественников или ХФУ станут видимыми под перевернутым микроскопом. Эта быстро растущая огромная колония ХФУ образовалась через 11 дней.

Как МСК, так и Е ХФУ могут быть приняты и расширены. Мы рекомендуем последующий анализ всех продуктов культуры с помощью проточной цитометрии для подтверждения соответствующего фенотипа. Следует помнить, что как эндотелиальные, так и мезенхимные линии реагируют на антитела, специфичные к CD 73, CD 1 46, CD 29 и CD 1 0 5.

Обратите внимание, что МСК экспрессировали бедренный один, который был обнаружен с помощью антитела против CD 90. Е ХФУ положительны на CD 31, который также называют молекулой адгезии эндотелиальных клеток тромбоцитов или pcam. Хорошо известно, что экспрессия иммунореактивности CD 34 в пуповине Е-ХФУ может быть снижена путем повторного культивирования.

Маркеры клеток крови, такие как CD 45, H-L-A-D-R и CD 14, оставались отрицательными для обоих типов клеток. Иерархия клеток-предшественников среди Е-ХФУ может быть оценена с помощью программного обеспечения Image J путем точного подсчета количества клеток каждой отдельной колонии. Мы только что показали вам, как изолировать, расширить и проанализировать булавы и ECE из кода пупки человека при выполнении этой процедуры.

Важно работать в стерильных условиях и проверять фенотип и чистоту перед использованием клеток в последующих исследованиях. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.