Визуализация одиночных молекул ДНК репликации с помощью флуоресцентной микроскопии

В этой технике стеклянные покровные стекла функционализируются смесью инертных молекул и молекул биотина. С этой функционализированной поверхностью создается проточная ячейка, которая помещается на газонный микроскоп. Биотинилированные шаблоны вращающихся кругов прикрепляются к поверхности с помощью поливалентного стрептавидина.

Когда субстраты реплицируются путем добавления белков зоны ответа и нуклеотидов, полученная двухцепочечная ДНК удлиняется с помощью ламинарного потока и визуализируется в режиме реального времени с использованием межсортировочного красителя. Здравствуйте, я Натан Таннер из лаборатории Антуана Ван Яна на кафедре биологической химии и молекулярной фармакологии Гарвардской медицинской школы. Я Джо Ларо, тоже из лаборатории Ван Нойана.

Сегодня мы покажем вам процедуру флуоресцентной визуализации репликации ДНК в режиме реального времени на уровне одной молекулы. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения скоординированной активности синтеза ДНК отдельных репликационных комплексов. Итак, приступим.

Чтобы начать эту процедуру, добавьте биотинилированный хвостовой олиго к одноцепочечной ДНК M 13, добавив десятикратный избыток олиго в буферный нагрев TBS до 65 градусов Цельсия, а затем выключите тепловой блок, чтобы обеспечить медленное охлаждение для надлежащего воздействия праймера. Теперь, когда прайм М 13 готов, добавьте его к смеси 64 наномолярной ДНК-полимеразы Т-7 и репликационного буфера Т-7, содержащего D NDPs и хлорид магния, и инкубируйте реакцию при 37 градусах Цельсия в течение 12 минут. В конце инкубации закалить 100 миллимолярной ЭДТА.

Затем очистите заполненную ДНК продукта фенолом, изоамиловым спиртом, хлороформом, экстрагируйте и диализируйте в TE-буфер или другой подходящий буфер для хранения, извлеките каждую органическую фазу для восстановления любого остаточного прайма. М 13 после диализа определяют концентрацию ДНК с помощью УФ-видимого спектрофотометра. За одну итерацию подготовки матрицы можно получить достаточную наномолярную концентрацию матрицы для сотен и тысяч экспериментов с одной молекулой.

Теперь, когда ДНК готова, приступайте к подготовке функционализированных покровных листков. Реплицируемая ДНК прикрепляется к стеклянным покровным стеклам, функционализированным с помощью Amil Lane, Oxy-группа Amil связывается со стеклом, оставляя амин доступным для связывания биотинилированных молекул ПЭГ. Это покрытие помогает уменьшить неспецифическое сцепление с поверхностью.

Чтобы тщательно очистить стекла от стеклопакетов, поместите их в банки для окрашивания и заполните банки ультразвуком этанола. В течение 30 минут промойте банки и залейте одним моляром гидроксид калия Sonicate на 30 минут и повторите обе промывки. Для первой реакции функционализации необходимо удалить все следы воды.

Наполните банки с окрашиванием ацетоном и ультразвуком в течение 10 минут. Опустошите банки и снова залейте ацетоном. Приступайте к добавлению синусоидального реактива в банки и перемешивайте в течение двух минут.

Затем гасят большим избытком воды. Затем просушите покровные листы, запекав их при температуре 110 градусов Цельсия в духовке в течение 30 минут. Затем приготовьте смесь ПЭГ из расчета около 0,2% веса на объем, при этом стеклянная защитная прокладка позволит отделить защитные колпачки, пипетка объемом 100 микролитров на сухую силосную защитную пластинку.

Положите сверху вторую крышку. Инкубируйте покровные стекла в растворе PEG в течение трех часов. Затем отделите каждую пару крышек и тщательно промойте водой.

Будьте осторожны, чтобы крышка была функциональной стороной вверх, так как только одна сторона будет покрыта колышком. Наконец, высушите покровные стекла сжатым воздухом и храните их под вакуумом в десикационной камере, поверхности сохраняют устойчивость не менее месяца. Таким образом, десятки покровных накладных могут быть изготовлены в партии и использоваться по мере необходимости.

Теперь, когда крышки готовы, можно собрать проточную камеру для эксперимента с одной молекулой. Начните с помещения от 20 до 25 миллилитров блокирующего буфера, содержащего BSA, в влагопоглотитель, чтобы удалить пузырьки воздуха для последующих этапов. Затем разведите 25 микролитров стрептавидина в 100 микролитрах PBS и распределите раствор по поверхности колышка и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы стрептавидин смог соединиться с поверхностным биотином во время подготовки других частей камеры.

Во время инкубации защитного стекла отрежьте кусок двустороннего скотча с подложкой с обеих сторон так, чтобы он соответствовал размеру кварцевого стекла, используемого для сборки проточной камеры. Отметьте карандашом расположение отверстий для трубок на ленте, чтобы на ленте можно было нарисовать контур проточной камеры. После разметки отверстий сделайте вокруг разметки прямоугольник шириной два миллиметра.

Этот прямоугольник будет служить проточным каналом, поэтому обязательно сделайте прямые стороны и оставьте место вокруг входного и выходного отверстия трубки. Теперь разрежьте отмеченную ленту по нарисованному контуру, делая прямые чистые надрезы, чтобы убедиться, что клей не выступает в канал. Тщательно очистите кварцевое стекло ацетоном, чтобы удалить клей с конструкции проточной ячейки, использованной в предыдущих экспериментах.

Найдите наилучшее выравнивание контура канала. Снимите одну сторону клейкой основы и осторожно поместите ленту на горку корта. Будьте осторожны, чтобы правильно выровнять ленту, так как входные и выпускные отверстия должны оставаться незаблокированными.

Затем подготовьте отрез трубки длиной 0,76 мм для входа и выхода проточной ячейки. Это помогает разрезать конец трубки под углом около 30 градусов, чтобы трубка не прижималась к дну камеры. Подвесьте трубки на штативы для пробирок для легкого крепления к проточной ячейке на следующих этапах.

К настоящему времени инкубация покровного стекла завершена. Промойте чехол с покрытием strep avid ENC, тщательно облейте водой и высушите сжатым воздухом. Будьте осторожны, чтобы не перевернуть крышку, так как функциональна только одна сторона.

Наконец, завершите сборку проточной камеры, сняв другую сторону подложки ленты и поместив кварцевое стекло на защитное стекло. Слегка надавите на защитное стекло, чтобы вытолкнуть воздух, попавший в клей. Это поможет предотвратить попадание пузырьков воздуха в проточный канал.

Заклейте боковые стороны камеры эпоксидной смолой. Вставьте отрезанную трубку в отверстия кварца, запечатайте на месте эпоксидной смолой и дайте высохнуть в течение нескольких минут. Когда эпоксидный герметик высохнет, начните блокировку поверхности.

С помощью иглы 21 калибра. Протяните часть блокирующего буфера Дегаса через одну из трубок. Промойте несколько раз, чтобы удалить пузырьки воздуха, и дайте камере инкубироваться не менее получаса, прежде чем переходить к репликации одной молекулы. Эксперимент.

Теперь, когда проточная ячейка заблокирована, поместите ее на предметный столик микроскопа. Удерживайте камеру на месте с помощью сценических зажимов и убедитесь, что проточный канал выровнен по оси y. Подсоедините выходную трубку проточной ячейки к шприцевому насосу с помощью соединительной трубки большего диаметра.

Поместите входное отверстие в буфер для блокировки и потяните шприц назад, чтобы удалить воздух из трубки. Легкое движение выпускной трубки поможет удалить пузырьки воздуха, попавшие в проточную камеру. Теперь добавьте ДНК, разбавьте стандартную матрицу ДНК до 25 пикомоляр в одном миллилитре блокирующего буферный поток в камеру с умеренной скоростью потока, например, 0,025 миллилитров в минуту в течение 30 минут, чтобы обеспечить хорошее покрытие поверхности ДНК.

Как только ДНК окажется в камере, промойте излишки ДНК с помощью блокирующего буфера для не менее 200 объемов проточных ячеек. Чтобы избавиться от всей свободной ДНК, включите лазер и камеру. Охлажденная ПЗС-матрица должна нагреться, прежде чем ее можно будет использовать.

После смывания избытка ДНК и дегазации репликационного буфера приготовьте реакцию репликации смеси нуклеотидов DTT и цитоксина в репликационный буфер. Затем добавьте белки и аккуратно перемешайте. Затем влейте реакционную смесь в проточную ячейку.

Скорость потока здесь должна быть достаточной, чтобы растянуть двухцепочечную ДНК на два миллиметра в ширину. Хорошо работает проточный канал высотой 100 микрометров 0,04 миллилитра в минуту. Дайте время для поступления смеси в камеру около 10 минут.

Переместите поле зрения в сторону канала и сфокусируйтесь на клейком материале, чтобы убедиться, что он находится рядом с поверхностью для фокусировки и начала визуализации. Отрегулируйте мощность лазерного микроскопа, фокусировку и угол наклона газона. Держите мощность на низком уровне, чтобы избежать расщепления окрашенной ДНК на фотографии.

Собирайте данные со скоростью от одного до пяти кадров в секунду в течение нескольких минут в зависимости от скорости репликации ДНК. Повторите, чтобы получить более длинные траектории репликации, или перейдите в новое поле, чтобы увидеть больше молекул, когда почти вся реакционная смесь попала в клеточный поток в большем буфере с цитом, чтобы увидеть другие поля зрения. Получение нескольких изображений различных реплицированных молекул позволяет получить статистику для определения продуктивности.

По кругу. Репликационный анализ: ведущий силовой синтез удлиняет хвост, соединяющий круг и поверхность, хвост преобразуется в двухцепочечную ДНК с помощью полимеразы отстающей цепи и растягивается показанным ламинарным потоком. Вот пример поля зрения с оранжевым цветом cyt при возбуждении 532 нанометра.

Маленькие флуоресцентные пятна представляют собой привязанные невоспроизводимые субстраты. Обратите внимание на чрезмерную длину товаров и большое количество товаров на поле. Типичное поле зрения покажет многочисленные реплицирующиеся молекулы, видимые по мере того, как растущие яркие линии окрашенной ДНК Coli эксперименты при температуре 37 градусов Цельсия дают от 5 до 50 молекул на поле в зависимости от плотности поверхности.

Зона T seven repla инициируется гораздо эффективнее и будет реплицировать более 50% молекул в поле. При такой высокой плотности трудно различить отдельные молекулы, как показано здесь. Итак, проведите эксперимент T 7 при более низких концентрациях белка или поверхностной плотности Графики Колокольчика типичных реплицирующихся молекул кишечной палочки и T 7 экспериментов включают конечные траектории молекул кишечной палочки и T 7 в зависимости от времени, когда траектории оснащены линейной регрессией для получения скоростей репликации, которые в данном примере составляют 467,1 пар оснований в секунду для кишечной палочки и 99,4 пар оснований в секунду.

Для T 7 распределения частот траекторий одиночных молекул, совпадающие с одиночными гауссионами, дают среднее значение 535,5 плюс-минус 39 пар оснований в секунду для кишечной палочки и 75,9 плюс-минус 4,8 пар оснований в секунду. Для T 7 распределения по длине продуктов репликации подгоняются с одним экспоненциальным распадом для получения продуктивности, которая составляет 85,3 плюс-минус 6,1 килобазовых пар для E-coli и 25,3 плюс-минус 1,7 килобазовых пар для G 7. Затем мы только что показали вам, как измерить скоординированную репликацию ДНК с отдельными молекулами.

При выполнении этой процедуры важно помнить о правильной функциональности крышных клинков и создании чистых каналов с прямым потоком. Обязательно сохраняйте мощность лазера и минимизируйте фоторасщепление длинной ДНК. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.