Автоматизированная система для одной молекулы флуоресцентной Измерения поверхностного иммобилизованных биомолекул
2 ноября 2009 г.
В этой статье мы опишем, как мы получаем FRET следы от отдельных молекул ДНК, иммобилизованных на поверхности с помощью автоматизированной сканирующей конфокальной микроскопии.
Для изучения динамики отдельных молекул в течение длительного периода времени необходимо сначала локализовать их в пространстве. Мы достигаем этого путем иммобилизации молекул на поверхности микрофлюидной ячейки. Процедура начинается со сборки ячейки, которая содержит четыре камеры, где будут зафиксированы биомолекулы.
Камеры соединены с внешней средой через входные и выходные капилляры. Кювета изготовлена путем припаивания структурированного диска из PDMS к кварцевому покровному стеклу. Затем собранная кювета устанавливается на флуоресцентный микроскоп, и к капиллярам подключаются гибкие трубки для облегчения замены растворов в камерах; чтобы сначала активировать поверхность для иммобилизации молекул, через один из каналов пропускают раствор биотинилированного BSA.
БСА адсорбируется на стенках камеры. Затем через поверхности пропускают раствор стрептавидина, который, в свою очередь, связывается с биотином. Наконец, пропускают биотинилированный олигонуклеотид, который связывается со стрептавидином, тем самым закрепляя интересующую молекулу на поверхности кварцевого покровного стекла.
Буфер для визуализации, разработанный для максимального увеличения стабильности и интенсивности флуорофоров, подается в камеру с постоянной скоростью на протяжении всего периода регистрации данных. Автоматизированная установка сканирует различные участки поверхности в поиске молекул, содержащих как донорский, так и акцепторный флуорофоры, после чего поочередно перемещает их в зону зондирования, регистрируя для каждой молекулы временной профиль интенсивности флуоресценции до полного выгорания обоих флуорофоров. Здравствуйте, я Николас Дифи из лаборатории профессора Миллера на кафедре биомедицинской инженерии Бостонского университета.
Сегодня мы продемонстрируем процедуру получения траекторий отдельных молекул F от иммобилизованных нуклеиновых кислот с использованием конфокальной установки. Мы применяем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения динамики нуклеиновых кислот, а также взаимодействий между нуклеиновыми кислотами и ферментами. Итак, приступим.
Микрофлюидная ячейка изготавливается путем припаивания структурированного диска из полидиметилсилоксана (PDMS) толщиной два миллиметра к свежеочищенному кварцевому покровному стеклу. Для изготовления структурированного диска из PDMS смешайте 10 частей основы силиконового эластомера с одной частью отвердителя, тщательно перемешайте и удалите пузырьки воздуха в вакууме в течение одного часа. После дегазации основы эластомера аккуратно залейте её в форму для микрофлюидной ячейки.
Оставьте смесь эластомера для отверждения на нагревательном столе при 70 °C в течение двух часов. После отверждения осторожно отделите диск из PDMS от формы с помощью лезвия бритвы. Диск из PDMS содержит четыре прямоугольных камеры объемом 30 µL.
Прикрепите плоскую сторону диска из PDMS (сторону без каналов) к стеклянному окну размером один дюйм, подвергнув обе поверхности плазменному окислению в течение 30 секунд. В стеклянном окне с обоих концов каналов предварительно просверлены восемь отверстий диаметром два миллиметра. Затем в каждое отверстие стеклянного окна вставляется гибкая капиллярная трубка из кварцевого стекла длиной два дюйма.
Для этого сначала вставьте иглу, а затем введите капиллярную трубку до достижения канала. Герметизируйте отверстия в стеклянном окне, используя быстроотверждаемый силиконовый компаунд для литья, такой как quick cast. Промойте каналы этанолом и водой после плазменной активации ячейки и свежеочищенного раствором пиранхи круглого кварцевого покровного стекла диаметром один дюйм в течение 30 секунд.
Приплавьте покровное стекло к боковой стороне кюветы с каналами. Теперь камеры герметизированы. Оставьте собранную кювету для отверждения на ночь при комнатной температуре.
После того как собранный микрофлюидный чип отвердеет в течение ночи, его помещают в специально изготовленный держатель и устанавливают на предметный столик конфокального микроскопа, чтобы приступить к активации поверхности ячейки. Для иммобилизации молекул соедините гибкие трубки с капиллярами ячейки, чтобы обеспечить введение буфера с помощью шприца и иглы. Затем введите в канал раствор биотинилированного BSA в концентрации 0.1 mg/mL в буфере A и инкубируйте в течение не менее 30 минут.
После 30-минутной инкубации пропустите от 300 до 500 µL буфера A, чтобы удалить из канала весь неабсорбированный биотинилированный BSA; при этом будьте осторожны, чтобы в камере не образовались пузырьки воздуха. Затем введите раствор STR din в концентрации 0,1 mg/mL в буфере A и инкубируйте в течение 15 минут.
После 15-минутной инкубации пропустите от 300 до 500 µL буфера А, чтобы удалить из канала любой неабсорбированный стрептавидин. Как и прежде, избегайте попадания пузырьков воздуха в камеру. В завершение пропустите раствор биотинилированного образца в концентрации от трех до пяти пМ.
Для проверки покрытия флуоресцентными молекулами проводят сканирование поверхности. Инкубируйте биотинилированный образец в течение 10 минут, затем повторите промывку буфером. Как было показано ранее, буфер для визуализации (IB) состоит из ферментативной системы поглощения кислорода и гасителя триплетных состояний, такого как trolox; сначала необходимо полностью растворить IB.
Пять миллиграммов trol растворяют в 10 миллилитрах глюкозного буфера, перемешивая на вортексе в течение нескольких минут и встряхивая не менее 10 минут. Раствор фильтруют и подвергают дегазации в вакууме в течение 10 минут. Раствор TRO lock осторожно смешивают с ферментативным раствором Glocky, избегая образования пузырьков воздуха.
Заполните резервуар раствором IB. Затем, используя механический шприцевой насос для контроля скорости потока, подайте раствор IB через канал с постоянной скоростью 5 µL/min; в резервуар с раствором IB продувайте аргон, чтобы предотвратить растворение атмосферного кислорода в буфере. Сканирование поверхности, локализация молекул и регистрация траекторий интенсивности одиночных молекул управляются программой LabVIEW, которая сканирует области размером 20 × 20 µm² с разрешением 0,2 µm и скоростью 0,1 µm/ms.
Данные поверхностного сканирования обрабатываются незамедлительно для определения координат всех пикселей, интенсивность которых превышает уровень фонового шума. После обнаружения иммобилизованных молекул каждая из них поочередно перемещается в конфокальный объем, и интенсивность излучения донорного и акцепторного флуорофоров регистрируется в зависимости от времени до полного фотообесцвечивания обоих флуорофоров. Затем предметный столик переводится в новую начальную точку на расстоянии 100 мм, и процесс сканирования повторяется.
Здесь показана собранная система MICROFLUID Excel. На представленных сканах поверхности видны одиночные молекулы в зеленом донорном и красном акцепторном каналах. Также приведены типичные трейсы одиночных молекул, где интенсивность акцептора отображена красным цветом, а донора — зеленым.
Мы только что продемонстрировали способ получения траекторий одиночных молекул иммобилизованных биомолекул с помощью конфокальной установки. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости тщательного соблюдения каждого этапа и не торопиться, так как данный эксперимент является сложным. На этом всё.
Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.
Обзор
В данной статье описывается метод получения FRET-кривых от отдельных молекул ДНК, иммобилизованных на поверхности, с использованием автоматизированного сканирующего конфокального микроскопа. Процесс включает локализацию и иммобилизацию биомолекул внутри микрофлюидной кюветы.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биофизика
- Флуоресцентная микроскопия
- Молекулярная биология
Теоретические сведения
- Изучение отдельных молекул требует точной локализации.
- Микрофлюидные ячейки облегчают иммобилизацию биомолекул.
- FRET (фёрстеровский резонансный перенос энергии) — это метод, используемый для изучения молекулярных взаимодействий.
- Автоматизированная сканирующая конфокальная микроскопия обеспечивает получение изображений с высоким разрешением.
Цель исследования
- Разработать надежный метод получения трейсов FRET для одиночных молекул.
- Изучить динамику нуклеиновых кислот и их взаимодействие с ферментами.
- Углубить понимание молекулярного поведения во времени.
Используемые методы
- Сборка микрофлюидной ячейки с несколькими камерами.
- Иммобилизация биотинилированных молекул на кварцевом покровном стекле.
- Поток имиджингового буфера для поддержания стабильности флуоресценции.
- Автоматизированное сканирование поверхности для регистрации кривых интенсивности флуоресценции.
Основные результаты
- Успешная иммобилизация нуклеиновых кислот на поверхности.
- Получение временных траекторий интенсивности флуоресценции для отдельных молекул.
- Демонстрация эффективности метода в изучении молекулярной динамики.
- Получение данных о взаимодействиях между нуклеиновыми кислотами и ферментами.
Выводы
- Разработанный метод представляет собой надежный подход к изучению динамики отдельных молекул.
- Он позволяет проводить детальный анализ молекулярных взаимодействий в режиме реального времени.
- Данная методика может быть применена в различных областях биологических исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Автоматизированные измерения FRET на уровне одиночных молекул позволяют осуществлять высокопроизводительный сбор данных о биомолекулярной динамике, что способствует валидации мишеней посредством количественного анализа взаимодействий с временным разрешением. Этот подход снижает неопределенность механизмов на ранних этапах поиска за счет получения статистически достоверных траекторий в контролируемых условиях, что служит основой для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки терапевтических средств, нацеленных на нуклеиновые кислоты. Данный метод повышает прогностическую уверенность при идентификации ведущих соединений, связывая молекулярное поведение с функциональными результатами в системах, релевантных для конкретного заболевания.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем количественного определения кинетики связывания и конформационных изменений иммобилизованных нуклеиновых кислот.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет длительных фотостабильных наблюдений за взаимодействиями отдельных молекул.
- Прогностическая ценность: позволяет получать количественные временные профили, которые служат основой для оценки достоверности мишени и сортировки портфеля препаратов на основе стабильности взаимодействий.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных, иммобилизованных на поверхности биологических систем для последующего скрининга соединений с получением стабильных показателей флуоресценции.
- Воспроизводимость: Обеспечение стандартизации анализа за счет микрофлюидного обмена буфера и контроля содержания кислорода в среде во всех повторностях.
- Масштабируемость: Возможность автоматизированного исследования тысяч молекул в течение ночи, что поддерживает проведение кампаний высококонтентного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: обеспечивает связь данных о взаимодействиях на этапе поиска с доклинической валидацией за счет поддержания условий буфера, релевантных для заболевания.
- Механистическое снижение рисков: проясняет механизмы взаимодействия нуклеиновых кислот с ферментами, уменьшая неопределенность в стратегиях модуляции мишени.
- Обоснованное продвижение с учетом рисков: поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя статистически значимые профили взаимодействия в физиологически релевантных условиях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс разработки лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации соединений-лидеров, что позволяет проводить количественную оценку биомолекулярных взаимодействий перед началом скрининга соединений.
- Открытия в биологии: упрощает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей за счет разрешения динамики иммобилизованных нуклеиновых кислот в режиме реального времени.
- Скрининг: обеспечивает создание воспроизводимых платформ, готовых к анализу, с количественными показателями флуоресценции для надежной оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет данные о локализации с учетом интенсивности и временнЫе зависимости сигналов донора/акцептора, что позволяет проводить сравнительный анализ условий.
- Трансляционные исследования: поддерживает контроль параметров окружающей среды (кислород, температура) для обеспечения непрерывности процесса от этапа открытия до валидации доклинического взаимодействия.
- Корпоративное повторное использование: создает автоматизированную, многократно используемую систему для устойчивого проведения одномолекулярного анализа по множеству мишеней и проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности благодаря прямому наблюдению.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость посредством микрофлюидного контроля и автоматизированного сканирования.
- Стратегическая ценность: улучшает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), повышает эффективность использования капитала и снижает биологические риски на поздних этапах программ по нуклеиновым кислотам.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию на основе рисков и принимать решения о дальнейшем продвижении, опираясь на количественные показатели стабильности взаимодействий.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области микрофлюидной сборки, химии поверхности и работы с конфокальным микроскопом.
- Зависит от инструментального оснащения, включая сканирующие конфокальные системы, шприцевые насосы и установки контроля условий окружающей среды.
- Необходимо межкомандное согласование протоколов приготовления буферов, пассивации поверхности и анализа данных.
- Требует учета особенностей адаптации для различных типов биомолекул и методов химической иммобилизации на поверхности.
- Включает такие практические ограничения, как конечные точки фотообесцвечивания и эффективность пассивации поверхности, влияющие на плотность молекул и качество треков.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Title
1:44
Introduction
2:12
Assembling the Microfluidic Cell
5:35
Activating the Surface of the Microfluidic Cell for Molecule Immobilization
7:31
Preparing the Imaging Buffer and Scanning the Sample
10:03
Time-Resolved Single Molecule FRET Traces of DNA Molecules
10:31
Conclusion
