Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки путем перепрограммирования человеческих фибробластов с Stemgent правам лентивирус TF Установить

Здравствуйте, меня зовут Брэд Гамильтон. Я работаю в отделе исследований и разработок в STEM Gen. Сегодня мы покажем вам процедуру перепрограммирования фибробластов человека с использованием факторов перепрограммирования, доставляемых лентивирусами.

Эта процедура может быть использована как для генерации IPS-ячеек, так и для изучения процесса перепрограммирования. IPS-клетки схожи с ES-клетками по морфологии, пролиферации и способности к дифференцировке, а также ко всем типам тканей организма. Человеческие IPS-клетки имеют явное преимущество перед ES-клетками, поскольку они проявляют ключевые свойства ES-клеток без этической дилеммы уничтожения эмбриона для получения клеток.

Создание специфических для пациента IPS-клеток позволяет обойти важное препятствие на пути к персонализированной регенеративной медицине, устраняя возможность иммунного отторжения неаутологичных трансплантированных клеток. Итак, приступим. В нескольких пунктах этого протокола вы заменяете среду развивающихся IPSC или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток на среду, кондиционированную метамфетамином.

Приготовление этого средства занимает шесть дней. Так что начните как минимум за неделю до начала эксперимента. Для начала засеваем каждую лунку по шестерке.

Хорошо проведите пластину с двух умно-10 на пятую часть одного питающего метамфетамина клеток в два миллилитра для роста метамфетамина. Среда инкубируется в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день смените среду на культуру клеток E-S-I-P-S человека.

Среда инкубируется в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Собирайте надосадочную жидкость и заменяйте свежей средой каждые 24 часа в течение четырех дней. Фильтруйте надосадочную жидкость через фильтр 0,22 микрометра.

Дополните собранный надосадочный слой 15 нанограммами на миллилитр основного фактора роста фибробластов BFGF. В конечном итоге вы получите около 16 миллилитров кондиционированной метамфетамина для хранения ежедневно собранной надосадочной жидкости отдельно при четырех градусах SIU. Кондиционированная метамфетаминовая среда может храниться в течение одной-двух недель при температуре четыре градуса Цельсия или в течение нескольких месяцев при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Теперь, когда вы убедились, что ваша кондиционированная метамфетамином среда будет готова, когда вам это понадобится, давайте поговорим о подготовке клеток. Первой задачей при создании IPSC является использование лентивирусов для трансдукции клеток фибробластов крайней плоти человека, или BJ-клеток с четырьмя транскрипциями, характерными для стволовых клеток. Подготовить к трансдукции затравку BJ клеток с плотностью один умножить на 10 до пятой клетки на лунку шестилуночного планшета и культуры.

Клетки в двух миллилитрах роста, среднем в течение ночи при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в тот же день. Начните приготовление тарелок для подачи метамфетамина, добавив два миллилитра 0,1% желатина, разведенного в воде, в чашку с шестью лунками и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Желатин покрывает лунки и служит матрицей для них.

Теперь клетки BJ готовы к лентивирусной трансдукции, чтобы подготовить вирус к трансдукции. Дополните два миллилитра свежей среды шестью микрограммами на миллилитр полимозгового мозга и четырьмя лентивирусами, каждый из которых экспрессирует один из факторов транскрипции человека. T четыре, SO два нанога и лин 28, так, что каждый из них имеет одинаковую кратность инфекции или MOI.

Все эти лентивирусы входят в набор факторов перепрограммирования человека лентивирусов. Чтобы выполнить трансдукцию, просто замените среду для роста клеток BJ средой, содержащей вирус. Аккуратно покачивайте пластину так, чтобы среда равномерно покрыла дно.

Инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в тот же день. Удалите один флакон cf с одной питательной клеткой метамфетамина из жидкого азота и разморозьте. Удалите желатиновый раствор с подающих пластин метамфетамина, которые теперь покрыты желатином на каждой.

Ну и добавьте 0,2 раза по 10 к пятым клеткам в два миллилитра метамфетамина роста. Терпимая. Инкубируйте MES в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день отделите клетки BJ с 0,05% трипсина ЭДТА и центрифугируйте при 200 G в течение пяти минут.

После центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в питательной среде. Удалите среду с пластины подачи метамфетамина и добавьте два миллилитра на лунку суспензии BJ-клеток. Концентрация BJ-клеток должна составлять примерно от пяти до 10-4 клеток на лунку.

Инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Через 24 часа после удаления клеток BJ на пластине кормушки метамфетамина замените среду человеческим E-S-I-P-S, то есть эмбриональным стволовым стволом или индуцированной культурой плюрипотентных стволовых клеток. Терпимая. Продолжайте менять носитель каждые 24 часа в течение семи дней.

На седьмой день замените среду для культивирования клеток ES двумя миллилитрами кондиционированной среды с метамфетамином. Клетки, питающиеся метамфетамином, обеспечивают растворимые факторы, необходимые для выращивания IPS-клеток. Но теперь нам нужно добавить больше этих факторов, чтобы сохранить культуру здоровой.

Кондиционированная метамфетаминовая среда содержит все растворимые факторы, выделяемые клетками, питающимися метамфетамином, инкубируются в течение ночи при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Посмотрев в прицел, выберите клеточную колонию. Отличается небольшим компактным куполообразным внешним видом в свежей 24-луночной пластине, которую вы предшествовали 24 часа назад с CCF, клетки одного фидера метамфетамина отступают от выбранной колонии в культуре E-S-I-P-S человека.

Среда дополнена 10 микромолярными молекулами ствола Y 2 7 6 3 2. Зависимый ингибитор киназы. Меняйте питательную среду без добавления молекулы стебля Y 2 7 6 3 2 каждые 24 часа в течение первых семи дней.

Через семь дней смените среду на метамфетамин. Состояние к среде продолжают проходить через клетки до тех пор, пока они не проявят типичную для человека морфологию ES-клеток. Ищите небольшие, компактные купола, такие как колонии, которые имеют острый край.

Колонии должны быть однородными и иметь высокое соотношение ядра и цитоплазмы. На данный момент у вас развились колонии, которые имеют морфологию ES-клеток, но экспрессируют ли они также гены, характерные для ES-клеток? Чтобы выяснить это, покрасьте колонии на маркеры плюрипотентности, такие как TRA 180 1 TRA один 60 SSEA четыре s, SE, три T четыре sox, два нанога и SSEA один Для начала аккуратно промойте клетки три раза PBS.

Далее зафиксируйте клетки 500 микролитрами 4%-ного параформа, альдегида или другого фиксатора на 20 минут при комнатной температуре. Через 20 минут промойте ячейки PB S3 еще раз, чтобы удалить излишки фиксатора. Затем заблокируйте неспецифическое связывание путем инкубации клеток в 500 микролитрах блокирующего буфера в лунку в течение одного часа при комнатной температуре После стадии блокирования добавьте 250 микролитров первичного антитела, разведенного в соотношении от одного до 100 в блокирующем буфере, к каждому.

Хорошо инкубируйте клетки первичного антитела в течение ночи при четырех градусах Цельсия на следующий день. Трижды промойте клетки PBS, чтобы удалить несвязанное первичное антитело. Инкубируйте клетки с 250 микролитрами вторичного антитела, разведенного в соотношении от одного до 300, и блокирующим буфером в течение одного часа при комнатной температуре, держа вдали от света, чтобы избежать фотообесцвечивания после инкубации со вторичным антителом.

Промойте ячейки трижды с PBS до третьей промывки. Добавьте DPI в дозе один микрограмм на миллилитр, чтобы окрашивать ядра. Наконец, проанализируйте экспрессию генов ваших IPS-клеток.

Под микроскопом морфобластные изменения, полученные под микроскопом, уже на четвертый день после трансдукции наблюдались морфологические изменения четырех клеток кожи человека, в которых cot трансдуцировался Т-4, SOX, два нанога и линь 28, а на 17-й день после трансдукции кластер клеток стал более плотно упакованным. Для дальнейшей характеристики изолированных колоний IPS-клеток мы искали наличие общих маркеров плюрипотентности, экспрессируемых в ES-клетках. Колонии проявляли сильную щелочную фосфатазную активность.

Кроме того, иммунохимию или ICC проводили на колониях клеток IPS с панелью специфических антител к плюрипотентным маркерам, включая поверхностные маркеры TA 180 1 TRA one 60 SSEA four и SS EEA 3, а также ядерные маркеры T 4, SOX 2 и Nanog. Изолированные колонии IPS были положительными по всем маркерам. Результаты ICC показывают, что IPS-клетки продемонстрировали соответствующий паттерн экспрессии маркеров плюрипотентности, демонстрируя, что эти IPS-клетки очень похожи на недифференцированные человеческие E-es-клетки.

Мы только что показали вам, как получить IPS-клетки путем перепрограммирования человеческих фибробластов стволовыми генами. Фактор перепрограммирования человека набор лентивирусов. При выполнении этой процедуры важно учесть несколько факторов.

Во-первых, для достижения оптимальной эффективности трансдукции может потребоваться изменение соотношения активного вируса и мишени на этапе первичной трансдукции. Во-вторых, это может повлиять на условия роста клеток-мишеней. Перепрограммирование здоровых и пролиферативных клеток более поддается перепрограммированию.

В-третьих, при модификации протокола для различных номеров клеток рекомендуется, чтобы номера целевых клеток были скорректированы пропорционально площади поверхности чашки для культивирования. Наконец, следует рассмотреть возможность применения ингибиторов горных пород, таких как Y 2 7 6 3 2, чтобы обеспечить успешное перепрограммирование, поскольку недавние исследования продемонстрировали его полезность в повышении выживаемости человеческих колоний. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.