Замораживание и размораживание человеческих эмбриональных стволовых клеток
24 декабря 2009 г.
Так как Джеймс Томсон и др. разработали методику в 1998 году, чтобы изолировать и выращивать ЭСК в культуре, замораживание клеток для последующего использования и оттаивания и расширения клетки из замороженного фондовом стали важными процедур, выполняемых в повседневной культуре клеток ЭСК. С ЭСК клетки очень чувствительны к стрессам, замораживания и оттаивания, особое внимание необходимо предпринять. Здесь мы показываем, правильную технику для быстрого таяния ЭСК клетки из ликвидных акций азота, покрытие их на мышиных эмбриональных клетках подачи, и медленно замораживания их для длительного хранения.
Здравствуйте, меня зовут Лия Кент, я представляю компанию STEM Gen. Сегодня мы покажем вам, как размораживать и замораживать эмбриональные стволовые клетки человека. Итак, приступим.
Для размораживания эмбриональных стволовых клеток человека криопробирку извлекают из жидкого азота и быстро размораживают. В водяной бане при 37 °C клеточную суспензию переносят из криопробирки в коническую пробирку, содержащую разбавляющую среду для культивирования ЭСК человека, и центрифугируют. Для получения небольшого клеточного осадка супернатант удаляют, после чего осадок клеток в пробирке ресуспендируют в свежей среде для культивирования ЭСК человека и высевают в одну лунку шестилуночного планшета для культивирования клеток, в которой предварительно был сформирован слой облученных фидерных клеток мыши (meth).
За один день до размораживания эмбриональных стволовых клеток человека высейте фидерный слой облученных эмбриональных фибробластов мыши или MEF в среду для культивирования в одну лунку шестилуночного планшета для культур тканей с гелатиновым покрытием. Инкубируйте планшет в течение ночи при 37 °C и 5% CO2.
Для обеспечения эффективного и успешного размораживания убедитесь, что всё необходимое оборудование и реагенты подготовлены. Перед извлечением человеческих ESL из жидкого азота с помощью металлических пинцетов достаньте криопробирку с человеческими E ESL из резервуара для хранения в жидком азоте.
Перекатывайте флакон между ладонями в перчатках в течение трех-пяти секунд. Чтобы удалить иней, снимите информацию с этикетки флакона с помощью металлических пинцетов. Поместите флакон в водяную баню при температуре 37 °C.
Осторожно перемешайте содержимое флакона круговыми движениями и часто, но быстро контролируйте процесс размораживания, рассматривая флакон на просвет, чтобы определить размер кристаллов льда. Не погружайте крышку флакона в водяную баню, так как это может привести к контаминации клеток.
Когда останется лишь небольшой кристалл льда, погрузите флакон в этанол для стерилизации внутри стерильного бокса биологической безопасности, затем перенесите содержимое криофлакона непосредственно на дно конической пробирки объемом 15 миллилитров. Медленно добавьте в пробирку четыре миллилитра среды для культивирования человеческих ЭСК.
Осторожно покачивайте пробирку, чтобы постоянно перемешивать клетки по мере добавления в нее новой среды. Центрифугируйте человеческие ЭСК в течение пяти минут при 200 Gs. Достаньте ранее подготовленную планшетную среду с фидерными клетками meth из инкубатора при 37 °C и подпишите ее, указав соответствующие данные о человеческих ESL, такие как линия клеток, номер пассажа и дата разморозки.
Отоспирируйте культуральную среду MEF и добавьте в лунку один миллилитр PBS. Перенесите осадок клеток human E ESL обратно в бокс биологической безопасности и осторожно отсопирируйте супернатант. Будьте осторожны, чтобы не аспирировать клеточный осадок, но удалите как можно больше супернатанта, так как этот раствор содержит DMSO из среды для замораживания. Ресуспензируйте.
Осторожно ресуспендируйте осадок, добавив 2,5 milliliters среды для культивирования человеческих ESL. Используя стеклянную пипетку объемом пять milliliter, три-четыре раза пропипетируйте и аспирируйте PBS из лунки с фидерными клетками MEF. Медленно добавьте все 2,5 milliliters суспензии человеческих ЭСК в подготовленную лунку шестилуночного планшета.
Поместите планшет в инкубатор при 37 °C и осторожно перемещайте его вперед-назад и из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить клетки по лунке. Это необходимо, чтобы избежать скопления колоний в центре. Не вращайте планшет круговыми движениями.
На следующий день после размораживания оставьте клетки для прикрепления при 37 °C и 5% carbon dioxide на ночь. Удалите среду вместе с любыми плавающими клетками и добавьте в лунку 2.5 milliliters свежей среды для культивирования человеческих ЭСК.
Инкубируйте планшеты при 37 °C и 5% CO2 в течение ночи и продолжайте культивирование до тех пор, пока колонии не будут готовы к пассированию. Протокол замораживания человеческих ЭСК начинается с использования здоровых колоний человеческих ЭСК среднего размера, культивируемых в шестилуночном планшете. После инкубации культуры с ферментом коллагеназой IV колонии соскабливают стеклянной пипеткой объемом 5 мл, собирают в коническую пробирку и центрифугируют для получения рыхлого клеточного осадка.
После аспирации супернатанта клеточный осадок ресуспендируют. Сначала используют среду для культивирования эмбриональных стволовых клеток человека, затем разводят двукратной средой для криоконсервации. Клетки равномерно распределяют по аликвотам объемом 1 мл и замораживают в криопробирках.
Пока клетки находятся в центрифуге, промаркируйте криопробирки внутри шкафа биологической безопасности, указав номер пассажа клеточной линии и дату заморозки. Типичная плотность при замораживании эмбриональных стволовых клеток человека составляет содержимое одной лунки шестилуночного планшета на одну криопробирку. После центрифугирования hESC перенесите пробирку обратно в шкаф биологической безопасности.
Отосберите супернатант из пробирки. Осторожно, чтобы не повредить рыхлый осадок клеток, ресуспендируйте его, добавив соответствующий объем культуральной среды для человеческих ESL.
В каждую криопробирку внесите по 0,5 миллилитров среды для культивирования человеческих ЭСК. При пипетировании действуйте очень осторожно, так как клетки ЭСК человека лучше восстанавливаются после разморозки, если они были заморожены в виде относительно крупных колониальных фрагментов. Медленно, осторожно встряхивая пробирку, добавьте к клеткам соответствующий объем двукратной (2x) среды для замораживания клеток ЭСК человека.
После добавления среды для замораживания перемешайте раствор крайне осторожным пипетированием, затем быстро, но аккуратно добавьте по 1 mL клеточной суспензии в каждую криопробирку. Перенесите пробирки в контейнер для замораживания с изопропанолом и поместите в морозильную камеру при температуре -80 °C на ночь. В контейнере с изопропанолом клетки будут замораживаться со скоростью 1 °C в минуту. На следующий день.
Быстро перенесите замороженные флаконы в резервуар с жидким азотом с помощью металлических пинцетов. В первый день после оттаивания эмбриональных стволовых клеток человека (hES cells) небольшие колонии могут выглядеть прозрачными, и их может быть трудно заметить под микроскопом. Поскольку недавно оттаянные hES cells имеют тенденцию к довольно медкой пролиферации.
Может потребоваться несколько дней культивирования, прежде чем они появятся в виде сформированных колоний. Мы только что продемонстрировали вам, как размораживать и замораживать культуры эмбриональных стволовых клеток человека. На этом все.
Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Обзор
В данной статье представлены правильные методы размораживания и замораживания эмбриональных стволовых клеток человека (hES). Особое внимание уделяется важности осторожного обращения с клетками в ходе этих процессов для обеспечения их жизнеспособности и успешного культивирования.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Исследования стволовых клеток
- Методы культивирования клеток
Теоретические сведения
- Эмбриональные стволовые клетки человека (hES) чувствительны к стрессу при замораживании и размораживании.
- Соблюдение надлежащей техники имеет решающее значение для поддержания жизнеспособности клеток.
- Процедуры размораживания и замораживания являются рутинными при культивировании клеток hES.
- Эти методы позволяют осуществлять долгосрочное хранение и последующее использование клеток hES.
Цель исследования
- Предоставить детальный протокол размораживания клеток hES из запасов в жидком азоте.
- Описать процесс замораживания для длительного хранения клеток hES.
- Обеспечить исследователям возможность эффективно работать с клетками hES, не нарушая их жизнеспособности.
Используемые методы
- Размораживание клеток hES в водяной бане при 37°C.
- Центрифугирование для получения клеточного осадка и ресуспендирование в культуральной среде.
- Посев клеток на фидерный слой облученных эмбриональных фибробластов мыши.
- Замораживание клеток в криопробирках с использованием контролируемой скорости охлаждения в контейнере с изопропанолом.
Основные результаты
- Успешное размораживание и посев hES-клеток привели к образованию жизнеспособных колоний.
- Правильные методы замораживания позволили сохранить целостность клеток для дальнейшего использования.
- После размораживания клетки демонстрировали медленную пролиферацию, что потребовало тщательного мониторинга.
- Были разработаны детальные протоколы как для процесса размораживания, так и для процесса замораживания.
Выводы
- Соблюдение описанных протоколов обеспечивает высокую жизнеспособность hES-клеток.
- Осторожное обращение при размораживании и замораживании имеет решающее значение для успешного культивирования клеток.
- Данные методы жизненно важны для исследователей, работающих с hES-клетками.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Надежная криоконсервация и восстановление человеческих эмбриональных стволовых клеток имеют основополагающее значение для поддержания банков плюрипотентных клеток в регенеративной медицине и рабочих процессах моделирования заболеваний. Правильная техника сводит к минимуму потерю жизнеспособности во время циклов замораживания-оттаивания, что обеспечивает стабильную воспроизводимость экспериментов и снижает потери на ранних стадиях валидации мишеней. Эти процедуры позволяют осуществлять долгосрочное хранение и доступ по требованию к генетически стабильным линиям hES-клеток для последующего скрининга и механистических исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Обеспечивает доступность генетически охарактеризованных hES-клеток для исследования путей развития заболеваний и функций терапевтических мишеней.
- Практическая ценность: Снижает необходимость в постоянном культивировании, уменьшая риск контаминации и трудозатраты на поддержание стволовых клеток.
Скрининг и разработка метода анализа
- Научная ценность: обеспечивает стандартизированный, жизнеспособный исходный материал для квалификации анализов и скрининга соединений в моделях на основе плюрипотентных клеток.
- Практическая ценность: обеспечивает согласованность готовности клеток от партии к партии, что повышает воспроизводимость анализов в рамках кампаний по скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает получение дифференцированного потомства из размороженных hES-клеток для моделирования заболеваний и тестирования доклинической эффективности.
- Практическая ценность: Облегчает масштабируемое расширение клональных линий для токсикологических исследований и исследований фармакологической безопасности.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Криоконсервация встраивается в процесс научных открытий, обеспечивая создание банков клеточных линий на этапах валидации мишеней, разработки анализа и доклинической оценки, что позволяет сохранить генетическую целостность для проведения лонгитюдных исследований.
- Биология открытий: Поддержание линий hES-клеток для проверки гипотез в исследованиях плюрипотентной дифференцировки и модуляции сигнальных путей.
- Скрининг: Обеспечение стабильной жизнеспособности клеток и эффективности посева для надежного скрининга библиотек соединений.
- Аналитика: Получение количественных показателей жизнеспособности через оценку эффективности прикрепления и формирования колоний после размораживания.
- Трансляционные исследования: Обеспечение получения дифференцированных клеток из законсервированных линий hES для создания доклинических моделей.
- Корпоративное повторное использование: Создание инфраструктуры банка клеток, применимой в нескольких проектах и терапевтических областях.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение достоверности прогнозов в клеточных анализах за счет минимизации генетического дрейфа и потери жизнеспособности.
- Операционная ценность: Стандартизированный и масштабируемый протокол криоконсервации снижает вариативность при работе с клетками в разных центрах.
- Стратегическая ценность: Снижает риск потери клеточных линий, обеспечивая непрерывность сроков реализации проектов и эффективность использования капитала.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию с учетом рисков, обеспечивая доступ к валидированным линиям hES для принятия решений о продолжении или прекращении исследований.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами стерильного культивирования и поддержания культур стволовых клеток.
- Необходим доступ к хранилищу с жидким азотом, водяным баням с температурой 37°C, центрифугам и шкафам биологической безопасности.
- Требуется стандартизированная маркировка и документация для обеспечения прослеживаемости пассажей клеток и дат заморозки.
- При адаптации протокола можно рассмотреть бесфидерные системы или определенные матрицы, хотя данный протокол предполагает использование фидерного слоя эмбриональных фибробластов мыши.
- Практические ограничения включают задержку пролиферации после размораживания и чувствительность к резким перепадам температуры при манипуляциях.
