Техника одновременно визуализировать вирус-специфических CD8 + T-клетки и инфицированные вирусом клетки В месте

Комбинируя гибридизацию in situ и тетраокрашивание в методе, известном как ISTH, можно определить относительное количество и пространственные отношения между вирусными антиген-специфическими иммунными эффекторными клетками и вирусно инфицированными клетками и тканями. ISTH начинается с внедрения свежих тканей, инфицированных SIV, в агроорганизмы. Ткань разрезается на участки толщиной 200 микрон с помощью вибрато и окрашивается на вирусный антиген.

Специфичные CD восемь положительных клеток с использованием меток C меченых тетрамеров MHC. После замораживания эти срезы окрашивания дополнительно разрезаются на срезы толщиной восемь микрометров с помощью криостата и выполняется гибридизация in situ для локализации вирусно инфицированных клеток. Конфокальная микроскопия используется для визуализации срезов двойного окрашивания и, в конечном итоге, для реконструкции исходных толстых срезов, чтобы выявить взаимосвязь между иммунным эффектором и клетками-мишенями.

Использование этой процедуры для обследования ранней инфекции ВИО оказалось хорошим предиктором тяжести последующего заболевания. Привет, я Чинен Ли из лабораторного дерева Эшли Х.А. на факультете микробиологии Университета Миннесоты. Меня зовут Пэм Скиннер, я доцент кафедры ветеринарных биомедицинских наук в Университете Миннесоты.

Сегодня мы покажем вам процедуру внутренней гибридизации в институте или сокращенно ИСТХ. В дополнение к использованию инци-окрашивания в сочетании с инци-гибридизацией, как мы демонстрируем сегодня, мы также регулярно используем инци-окрашивание в сочетании с иммуногистохимией для определения местоположения, распространенности и профиля экспрессии белка антиген-специфических CD-восьми Т-клеток in situ u. Помогать нам сегодня с окрашиванием толстых срезов на месте будут д-р Хеон Ким и Терри Матала, а также помогать нам с подготовкой тонких срезов и гибридизацией in situ будет Итак, давайте начнем.

Чтобы начать эту процедуру, охладите ванну Вибрам, содержащую стерильный ПБШ, до нуля до двух градусов Цельсия. Установите угол наклона лопасти вибратора на 27 градусов. По возможности храните свежие салфетки охлажденными на льду и начинайте процедуру в течение 24 часов после забора тканей.

Чтобы свести к минимуму охлаждение при разложении, вибрам также облегчает разрезание свежей ткани, обрезайте соединительную ткань и разрезайте образец скальпелем на мелкие кусочки, а затем поместите кусочки в лодку для сыворотки и накройте 4% низким расплавом. Агрос в PBS плавился при температуре около 40 градусов по Цельсию. Убедитесь, что ткань соприкасается со дном посуды, и нажмите на кусочки ткани, если они плавают, затвердевают на льду в течение трех-пяти минут.

Здесь используется ткань селезенки, но лимфатический узел, влагалище, шейка матки, матка или другие свежие ткани также могут быть использованы с помощью скальпеля. Разрежьте агрос вокруг ткани и с помощью щипцов аккуратно перенесите внедренную ткань агроса в тканевый блок. Продолжайте, покрыв тканевый блок Vibram клеем Loctite.

Не перемещайте кусок ткани после того, как он установлен на тканевом блоке. Дайте обсохнуть около 10 минут на льду. Затем установите тканевый блок в вибратор и разрежьте ткань на участки толщиной 200 микрометров, используя очень медленную скорость движения вперед и относительно высокую амплитуду.

С помощью кисти переложите срезанные срезы в специализированную тканевую камеру, установленную в лунке 24-луночного тканевого планшета, предварительно заполненного одним миллилитром охлажденного ПБШ. Поместите до четырех срезов ткани в каждую тканевую камеру. Пометьте образцы и прикрепите крышку к пластине с помощью резиновой ленты, чтобы окрашивать участки ткани для вирусных специфических Т-клеток.

Конъюгированные тетрамеры ZI сначала разводят в блокирующем буфере до nwt 0,5 мкг на миллилитр. Раствор пипетируется в 24-луночный планшет по одному миллилитру на лунку. Свежесрезанная ткань переносится на пластину в тканевых камерах и выдерживается в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия.

Держите пустую лунку между тканевыми камерами, содержащими различные образцы, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение растворов на последующих этапах. На этом этапе можно добавить антитела, направленные против внеклеточных белков или белков клеточной поверхности. Для промывки подготовьте 24-луночный планшет для культуры тканей, содержащий охлажденный ПБШ после первичной инкубации.

Простирайте дважды, переложив тканевые камеры на предварительно заполненную пластину на 20 минут, каждый раз обязательно слейте большую часть жидкости из тканевых камер перед переносом. Также не капайте содержимое одного образца в другой при перемещении тканевых камер и следите за срезами в тканевых камерах, чтобы убедиться, что они не прилипают к бортам. После фиксации срезы зафиксировать свежим 4%-ным паральдегидом в PBS на два часа при комнатной температуре.

Промывают дважды холодной ПБШ по пять минут каждый раз для усиления сигнала от тетрамеров. Инкубируйте секции с антителами кролика против фитзи в соотношении один к 10 000 в блокирующем буфере в течение одного-трех дней. На этом этапе можно добавлять антитела против внутриклеточных эпитопов.

Обязательно проникайте в клетки и блокируйте неспецифические участки перед добавлением антитела. Извлечение антигена может потребоваться и после второй длительной инкубации, направленной на усиление сигнала. Промыть срезы в ПБШ трижды не менее 20 минут и каждый раз до нескольких часов.

Проведите заключительную инкубацию с соответствующими флуоресцентно мечеными антителами. Например, можно использовать козий анти-кроличий SI-3 для связывания анти-фитзи-антител кролика, чтобы заставить тетрамерные красильные клетки флуоресцировать красным цветом. Если мышиные антитела использовались для противодействия представляющим интерес белкам, таким как CD 8, для визуализации киллеров Т-клеток, можно использовать козий анти-УЗИ Alexa 488 для связывания с мышиными антителами и принуждения клеток окрашивания антител флуоресцировать зеленым цветом.

Инкубируйте в течение одного-трех дней, защищайте срезы от света, оборачивая пластины и фольгу во время этой инкубации, а затем, по мере легкого гашения, флора опадает. Наконец, снова зафиксируйте срезы, чтобы закрепить тетрамеры и антитела на месте. Вымойте и установите на предметное стекло микроскопа с глицериновым желатином, содержащим четыре миллиграмма на миллилитр N профиля галлата для хранения при температуре минус 20 градусов Цельсия до подготовки тонких срезов для гибридизации in situ.

Срезы окрашивания тетрамеров insitu теперь могут быть проанализированы с помощью конфокального микроскопа, чтобы определить локализацию, распространенность и характер экспрессии белка антиген-специфических CD восьми положительных Т-клеток на показанном изображении: срезы ткани селезенки из инфицированного SIV углубления meac были окрашены тетрамерами gag для мечения специфичных для SIV CD, восьми положительных Т-клеток, антител CD 20 и антител CD 3. Так как счетчики окрашивания антителами будут потеряны на следующем этапе. Прежде чем двигаться дальше, важно провести анализ тетрамеров in situ.

Начните процедуру тонкого среза, нагревая срезы толщиной 200 микрон при температуре 70 градусов Цельсия в течение пяти минут на нагревательном блоке, чтобы отделить толстые срезы от предметного стекла. После того, как секции отсоединены, поместите их в OCT на сухой лед, предварительно заполнив дно пластиковой формы OCT. Затем поместите салфетку поверх ОКТ и накройте ее ОКТ.

С помощью криостата вырежьте секции толщиной восемь микрон из заложенных секций ОКТ и приклейте секции толщиной восемь микрон к разрозненным предметным стеклам. Затем предметные стекла можно хранить при температуре минус 80 градусов Цельсия в герметичной коробке для последующей гибридизации in situ. Стандартная гибридизация in situ используется для обнаружения вирусно инфицированных клеток с помощью меченых S 35 вирус-специфических реберных зондов.

Процедура также включает в себя нанесение покрытий на секции ядерной эмульсией и монтажные направляющие. Во флуоресцентной совместимой среде первостепенные конфокальные изображения получаются с помощью конфокального микроскопа BioRad MRC 1000, который оснащен устройством синего отражения в эпитрубке. Окрашивание insitu tetra визуализируется с помощью EPI one 605 для красного тетрафлуорохрома и EPI 2 522 DF 32 для зеленого CD восьмого флуорохрома для insitu-гибридизации.

Используйте два синих отражения EPI для зерен серебра, полученных в результате сигнала гибридизации in-situ в разработанных радиоавтографах. Чтобы начать получение изображений, получите изображения из каждого раздела слева направо и сверху вниз и убедитесь, что каждое изображение перекрывается примерно на 20% с соседними изображениями. Чтобы избежать пробелов в восстановленном монтажном изображении, назовите каждое изображение в соответствии с его братом и столбцом в файле Excel.

Когда сбор данных со слайдов будет завершен, используйте конфокальную вспомогательную программу для проецирования серийных изображений Z для каждого канала в одно изображение с помощью процедуры семи действий Photoshop, доступной у авторов, автоматически объедините проецируемое изображение из трех каналов в одно изображение RGB. Затем сшейте объединенные изображения слоями, чтобы создать монтажное изображение всего раздела. Свяжите отдельные серебряные зерна и пятно тетрамера с клетками в монтаже с помощью метаморфа или фотошопа.

Присвойте координаты XY центров или OID вирусных РНК-положительных и тетрамеров-положительных клеток. Экспортируйте данные OID в файлы Excel в виде числовых номеров для каждой клетки и используйте данные, собранные в файлах Excel, для определения соотношения иммунных эффекторов или e-клеток к вирусным мишеням или Т-клеткам из общего числа тетрамеров-положительных и вирусных РНК-положительных клеток в разрезе, чтобы зафиксировать пространственные отношения между тетрамеров-положительными и РНК-положительными клетками. Скопируйте и вставьте соответствующие графики из файлов Excel в документ Photoshop в Photoshop.

Уменьшите непрозрачность слоя, чтобы выровнять и масштабировать сетки так, чтобы они совпадали по цвету, выделите, а затем скопируйте и вставьте в новый слой. Положения синих РНК-положительных клеток отбрасывают слой, используемый для выравнивания сеток, а положения тетрамеров-положительных и вирусных РНК-положительных клеток будут показаны на сплющенном изображении. Используя показанный здесь метод ISTH, мы можем проследить иммунный ответ на инфекцию SIV после интравагинальной инокуляции у этих входных ворот и в лимфатических тканях, на которые распространяется инфекция.

Через 10 дней после заражения в этих участках тканей имеется большое количество инфицированных клеток, но уже через три дня появляются зеленые окрашенные CD A клетки, но еще не сейчас. Окрашенные в красный цвет специфичные тетраположительные клетки SIV. Таким образом, иммунный ответ слишком запоздал, чтобы избавиться от инфекции.

Однако уже через три недели после заражения отчетливо видно уменьшение инфицированных клеток, особенно у ворот входа. Мы использовали ISTH, чтобы показать, что степень снижения коррелирует с пространственной близостью и относительным числом положительных иммунных эффекторных клеток тетрамеров. N-S-I-V-R-N-A положительные клетки-мишени, мы называем это соотношением E к T in vivo.

Пространственные отношения легко визуализируются с помощью этого метода: эффекторные клетки выделены красным цветом, а вирусные мишени — синим цветом в этом инфицированном лимфатическом узле. Многие эффекторные и целевые клетки находятся в непосредственной близости, и есть области, где множество эффекторных клеток окружают одну S-I-V-R-N-A положительную клетку, в то время как в других областях S-I-V-R-N-A стоит отдельно. Коэффициент ETT просто вычисляется по мере определения положения ячеек и регистрации по номерам каждой из них в файле Excel.

Наилучший контроль над вирусной инфекцией коррелирует с большим превышением красных эффекторов над зелеными мишенями 43 к одному. В этом случае в шейке матки и влагалище, где началась инфекция, соотношение ЭТТ было ниже в лимфатических узлах. Положительная корреляция между высокими коэффициентами ETT и снижением вирусной нагрузки с пика указывает на то, что более устойчивый иммунный ответ у входа приводит к лучшему контролю инфекции.

Мы только что показали вам, как одновременно обнаруживать очень специфические клетки CDAT и клетки вирусной инфекции in situ. Этот метод позволяет одновременно визуализировать антиген-специфические Т-клетки и инфицированные вирусом клетки в тканях. Этот метод может быть применен для оценки вакцины на основе CD 8 положительных Т-клеток и другого неценного взаимодействия патогена с хозяином При выполнении этой процедуры.

Важно сохранить все РНК реагентов свободными до начала гибридизации. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.