Добыча высокомолекулярных ДНК Геномная Вес от почвы и осадков

Здравствуйте, я Сан Ли из лаборатории Стивена Харлема кафедры микробиологии и иммунологии Университета Британской Колумбии. Сегодня мы продемонстрируем процедуру экстракции высокомолекулярной геномной ДНК из лесных почв, которая также применима к широкому спектру типов почв и донных отложений. Мы используем высокомолекулярную геномную ДНК для создания форестером-библиотеки почвенных микробных сообществ.

Имея эти библиотеки, мы можем изучить разнообразие и метаболический потенциал микробных сообществ, распределенных по различным почвенным горизонтам. Итак, приступим. Данный протокол начинается с лизиса клеток.

Первым шагом является доведение денатурирующего буфера до готовности путем добавления бета-меркаптоэтанола до концентрации 0.5%. Для достижения наилучших результатов готовьте денатурирующий раствор непосредственно перед использованием. В качестве альтернативы можно использовать буфер, приготовленный не более недели назад и хранившийся при температуре четырех градусов Цельсия. Для следующего этапа вам понадобятся сосуд с жидким азотом, автоклав, предварительно охлажденные ступка с пестиком и шпатель.

Поместите две грамма замороженного образца почвы в предварительно охлажденную ступку. Добавьте один миллилитр денатурирующего раствора. Затем добавьте жидкий азот так, чтобы полностью покрыть почву.

Используйте предварительно охлажденный пестик для измельчения образца до тех пор, пока частицы почвы не станут порошкообразными и однородными, а сам образец не начнет плавиться. Затем добавьте еще жидкого азота и повторите этап измельчения. Таким образом завершается этап лизиса клеток с использованием предварительно охлажденного шпателя.

Перенесите измельченный образец в коническую пробирку объемом 50 мл. Держите образец на льду для немедленного перехода к этапу экстракции ДНК или храните при температуре -80 °C. Для последующего использования, непосредственно перед началом экстракции ДНК, доведите экстракционный буфер до готовности, добавив гексадецилтриметиламмоний бромид (CTAB) и SDS.

Проверьте, не кристаллизовался ли CTAB; если это произошло, перед дальнейшим использованием растворите его при 60 °C. Затем добавьте его в раствор до достижения общей концентрации 1%. Далее добавьте 20% раствор SDS до конечной концентрации 2%. Образование молочно-белой суспензии является нормальным явлением.

После добавления SDS поддерживайте однородность готового экстракционного буфера, выдержав его при температуре 60 °C в течение 10–15 минут. Когда экстракционный буфер полностью растворится и станет однородным, добавьте 9 мл буфера к пробе почвы и кратковременно перемешайте на вортексе на низкой скорости. Инкубируйте пробу с экстракционным буфером в гибридизационном oven при температуре 65 °C в течение 40 минут.

Во время инкубации осторожно переворачивайте пробирки каждые 10 минут или непрерывно вращайте их на минимальной скорости ротора. По окончании инкубации раствор может стать слегка вязким. Следующим этапом является использование смеси хлороформа и изоамилового спирта для очистки ДНК от органических веществ, содержащихся в лизирующей смеси.

Начните с центрифугирования образца в вытяжном шкафу в течение 10 минут при 1800 Gs при температуре примерно от 10 до 14 °C; соберите супернатант, содержащий ДНК, осторожно скользя наконечником пипетки по стенке пробирки, чтобы не задеть бежевый слой сверху и органический слой снизу. Перенесите супернатант в предварительно охлажденную пробирку объемом 50 мл, содержащую 20 мл смеси хлороформа и изоамилового спирта (CIA). Затем повторите процесс экстракции еще дважды для того же образца. Тем временем держите экстракт ДНК и смесь хлороформа и изоамилового спирта на льду в вытяжном шкафу.

Для второй экстракции ДНК вернитесь к пробирке с осадком почвы и остатками буфера для экстракции, затем добавьте еще 5 мл буфера для экстракции. Осторожно перемешайте содержимое наконечником на 1 мл и коротко перемешайте на вортексе для ресуспендирования осадка, как и в предыдущий раз. На этот раз инкубируйте при 65 °C в течение 10 минут.

Затем центрифугируйте при 1800 Gs в течение 10 минут. Находясь под вытяжным шкафом при температуре примерно от 10 до 14 °C, перенесите супернатант в пробирку, содержащую хлороформ, изоамиловый спирт или смесь хлороформ-изоамиловый спирт (CIAA), и супернатант от предыдущей экстракции. Повторите весь процесс экстракции еще раз, чтобы извлечь из образца почвы максимально возможное количество ДНК.

После завершения в общей сложности трех экстракций вашего образца почвы очень осторожно встряхните пробирку, содержащую собранный супернатант и хлороформ, на ротаторе со скоростью 1,25 об/мин в течение 10 минут. После этого этапа перемешивания центрифугируйте пробирку при 1800 G в течение 20 минут при температуре примерно от 10 до 14 °C. После центрифугирования осторожно перенесите водную фазу в новую ультрацентрифужную пробирку, оставив один-два миллилитра супернатанта, чтобы не нарушить границу раздела между водной и органической фазами. Теперь для осаждения ДНК добавьте 0,6 миллилитра изопропилового спирта.

На каждый миллилитр собранного супернатанта аккуратно переверните пробирки несколько раз для перемешивания. На этом этапе можно увидеть выпадение ДНК в осадок в виде длинных нитей. Затем инкубируйте ДНК с изопропанолом в течение 30 минут при комнатной температуре.

После инкубации необходимо осадить ДНК путем центрифугирования. Помещая пробирку в центрифугу, отметьте один её край, чтобы знать, где должен образоваться осадок ДНК. Центрифугируйте при 16,000 GS в течение 20 минут при температуре от 20 до 25 °C. После центрифугирования удалите изопропиловый спирт путем декантации и/или вакуумного отсасывания. Будьте осторожны, чтобы не потерять осадок ДНК, размер которого может варьироваться от почти невидимого до 9 мм в ширину в зависимости от эффективности экстракции и биомассы в образцах почвы. Высушите осадок ДНК при комнатной температуре в течение 5–20 минут. Старайтесь не пересушить осадок.

Ресуспендируйте ДНК в 200–400 µL ТЕ-буфера. Перемешайте раствор легким постукиванием. Перенесите раствор ДНК в пробирку объемом 1,5 мл.

Храните ДНК при температуре four degrees Celsius в течение ночи. Чтобы полностью растворить ДНК после ее экстракции из пробы почвы, выполните последующие этапы проверки концентрации и целостности ДНК образца согласно стандартным процедурам, которые подробно описаны в другом протоколе JoVE из лаборатории Hallam. Определите концентрацию ДНК выбранным вами методом.

Также проверьте целостность высокомолекулярной ДНК, проанализировав 10–20 µL вашего образца ДНК с помощью гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE). Медианный размер ДНК должен составлять 36 kb или более, в зависимости от последующего применения. Перейдите к следующему этапу центрифугирования в градиенте хлорида цезия; альтернативно, до ультрацентрифугирования ДНК можно хранить при -20 °C или -80 °C.

Следующим этапом является использование центрифугирования в градиенте хлорида цезия для дальнейшей очистки ДНК путем удаления примесей, после чего следует концентрирование и дополнительная очистка ДНК с помощью центрифужных фильтрующих устройств AmCon и MicroCon. Центрифугирование в градиенте хлорида цезия имеет решающее значение для получения высококачественной ДНК и подробно описано в другом протоколе JoVE из лаборатории Hallam. После выполнения этапов центрифугирования в градиенте хлорида цезия и концентрирования проверьте концентрацию ДНК любым удобным для вас способом.

Затем еще раз проверьте целостность высокомолекулярной ДНК, проанализировав небольшой образец ДНК с помощью PFGE. Общее количество геномной ДНК, выделенной из двух граммов почвы, составляет от 10 до 180 микрограмм, что видно по результатам электрофореза до и после ультрацентрифугирования с хлоридом цезия. Размер выделенной ДНК обычно варьирует от 40 до 60 килобаз; здесь представлена хроматограмма образцов геномной ДНК до и после ультрацентрифугирования с хлоридом цезия.

Данный этап повышает чистоту ДНК, увеличивая соотношение 260/280 с 1,3–1,6 до 1,8–1,9. Кроме того, после центрифугирования удалось снизить пик поглощения на длине волны 230 нм, что свидетельствует об уменьшении загрязнения гуминовыми кислотами. Мы продемонстрировали вам способ выделения высокомолекулярной геномной ДНК из почвенных микробных сообществ.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости приготовления буфера для экстракции и денатурации в точном соответствии с инструкцией. Также следует проявлять осторожность, чтобы не задеть осадок ДНК после осаждения изопропанолом. Когда вы извлекаете полосу ДНК после центрифугирования в хлоридном градиенте.

Не забудьте промыть шприц буфером TE, чтобы максимизировать выход ДНК. И, наконец, обязательно проверьте количество и качество выделенной ДНК на всех рекомендуемых этапах. На этом всё.

Спасибо за просмотр и удачи в проведении вашего эксперимента.