Добыча высокомолекулярных ДНК Геномная Вес от почвы и осадков

Здравствуйте, я Сан Ли из лаборатории Стивена Гарлема на факультете микробиологии и иммунологии Университета Британской Колумбии. Сегодня мы покажем вам процедуру высокомолекулярной геномной экстракции ДНК из леса в почву, которая также применима к широкому спектру типов почв и отложений. Мы используем высокомолекулярную геномику, ДНК для построения библиотеки почвенных микробных сообществ.

Имея в руках эти библиотеки, мы можем изучать разнообразие и метаболический потенциал микробных сообществ, разделяющихся между различными почвенными горизонтами. Итак, приступим. Этот протокол начинается с лизиса клеток.

Первым шагом является завершение денатурирующего буфера добавлением бета-мера каптоэтанола до концентрации 0,5%. Для достижения наилучших результатов каждый раз делайте денатурирующий раствор свежим. В качестве альтернативы используйте буфер возрастом менее одной недели, который поддерживался при температуре четыре градуса Цельсия. Для следующего шага вам понадобится жидкий азот, автоклав и предварительно охлажденный ступчатый пестик и шпатель.

Поместите двухграммовый образец замерзшей почвы в предварительно охлажденный раствор. Добавьте один миллилитр денатурирующего раствора. Затем добавьте жидкий азот, чтобы полностью покрыть почву.

С помощью предварительно охлажденного пестика измельчите образец до тех пор, пока частицы почвы не станут порошкообразными и однородными, а образец не начнет плавиться. Затем добавьте еще жидкого азота и повторите этап измельчения. На этом этап лизиса клеток завершается с помощью предварительно охлажденного шпателя.

Переложите измельченный образец в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Держите образец на льду, чтобы сразу приступить к этапу экстракции ДНК, или храните при температуре минус 80 градусов Цельсия. Для использования в литре, непосредственно перед началом экстракции ДНК, завершите экстракцию буфером, добавив гекса-деко триметиламмония бромид или CTAB и SDS. Первый.

Проверьте, кристаллизуется ли CTAB, и если да, растворите его при 60 градусах Цельсия, прежде чем продолжить. Затем добавьте его в раствор до общей концентрации 1%Далее добавьте 20%-ный раствор SDS до конечной концентрации 2%-ной молочной суспензии. Это нормально.

После добавления паспорта безопасности поддерживайте однородность готового буфера экстракции, храня его при температуре 60 градусов Цельсия через 10–15 минут. Как только экстракционный буфер хорошо растворится и станет однородным, добавьте девять миллилитров экстракционного буфера в образец почвы и кратковременно перемешайте вихрь на низкой скорости. Инкубируйте образец с экстракционным буфером в печи для гибридизации при температуре 65 градусов Цельсия в течение 40 минут.

Во время инкубации осторожно переворачивайте трубки каждые 10 минут или непрерывно вращайте трубки с наименьшей скоростью ротора. Во время инкубации раствор может казаться слегка вязким после инкубации. Следующим шагом является использование хлороформаизоамилового спирта для очистки ДНК от органического материала в смеси для лизиса.

Начните с центрифугирования образца в течение 10 минут при давлении 1800 G при температуре от 10 до 14 градусов Цельсия в колпаке, соберите ДНК, содержащую надосадочную жидкость, осторожно проведя кончиком пипетки по боковой стороне пробирки, избегая бежевого слоя сверху и органического слоя внизу. Перенесите надосадочную жидкость в предварительно охлажденную 50-миллилитровую пробирку, содержащую 20 миллилитров хлороформа спирта ISL, или через следующий раз повторите процесс экстракции еще два раза на том же образце. Между тем, храните экстракт ДНК и хлороформ на льду в капюшоне.

Для второго извлечения ДНК вернитесь к пробирке, содержащей почвенную гранулу с остаточным буфером для экстракции, и добавьте еще пять миллилитров буфера для экстракции. Осторожно перемешайте с помощью кончика объемом в один миллилитр, чтобы перемешать, и кратковременно перемешайте, чтобы вернуть гранулу, как и раньше. Инкубируйте при температуре 65 градусов Цельсия на этот раз в течение 10 минут.

Затем центрифугируйте при 1800 G в течение 10 минут. При температуре от 10 до 14 градусов Цельсия в капюшоне перенесите надосадочную жидкость в пробирку, содержащую хлороформ, изоамиловый спирт или хлороформ i a a и надосадочную жидкость от предыдущей экстракции. Повторите весь процесс экстракции еще раз, чтобы извлечь как можно больше ДНК из образца почвы.

После того, как вы завершите в общей сложности три экстракции образца почвы, очень осторожно встряхните пробирку, содержащую собранный наднатант и хлороформ i a a a на вращающейся пластине при 1,25 RRP м. После этого этапа смешивания центрифугируйте пробирку при 1800 G в течение 20 минут при температуре около 10-14 градусов Цельсия. После центрифугирования осторожно перенесите водную фазу в новую ультрацентрифужную пробирку, оставив от одного до двух миллилитров SNAT во избежание нарушения границы раздела между водной и органической фазами. Теперь для осаждения в ДНК добавляют 0,6 миллилитра изопропилового спирта.

К каждому миллилитру собранной надосадочной жидкости аккуратно переверните трубочки несколько раз для перемешивания. На этом этапе вы можете увидеть, как ДНК выпадает в осадок в длинные нити. Затем инкубируйте ДНК с изопропанолом в течение 30 минут при комнатной температуре.

После инкубации пришло время гранулировать ДНК методом центрифугирования, отметьте один угол пробирки, когда вы помещаете ее в центрифугу, чтобы вы знали, где ожидать вращения гранулы ДНК при 16 000 GS в течение 20 минут при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия после центрифугирования, удаления изопропилового спирта путем декантации и/или вакуумной аспирации. Будьте осторожны, чтобы не потерять гранулу ДНК, размер которой варьируется от едва видимой до девяти миллиметров в ширину, в зависимости от эффективности извлечения и биомассы в образцах почвы, высушите гранулу ДНК при комнатной температуре от пяти до 20 минут. Будьте осторожны, чтобы не пересушить, когда гранулы высохнут.

Ресуспендировать ДНК в дозе от 200 до 400 микролитров. Перемешайте его легкими постукивающими движениями. Переложите раствор ДНК в пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Храните ДНК при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. Для того, чтобы полностью растворить ДНК после того, как ДНК была извлечена из образца почвы, оставшиеся этапы проверки концентрации и целостности ДНК образца являются стандартными процедурами, которые подробно описаны в другом протоколе JoVE из лаборатории Халлама. Определите концентрацию ДНК с помощью выбранного вами метода.

Также проверьте целостность высокомолекулярной ДНК, выведя от 10 до 20 микролитров образца ДНК с помощью гель-электрофореза с импульсным полем или PFGE. Средний размер ДНК должен составлять 36 килооснований или более в зависимости от вашего последующего применения. Перейдите к следующему этапу центрифугирования с градиентом хлорида цезия в качестве альтернативы, ДНК может храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия или минус 80 градусов Цельсия перед ультрацентрифугированием.

Следующим шагом является использование градиентного центрифугирования хлорида цезия для дальнейшей очистки ДНК путем удаления примесей после концентрата градиентного центрифугирования хлорида цезия, а также дальнейшая очистка ДНК с помощью центробежных фильтрующих устройств AmCon и MicroCon. Центрифугирование на основе градиента хлорида цезия является ключом к достижению высокого качества ДНК и подробно описано в другом протоколе JoVE из лаборатории Халлама. После выполнения этапов центрифугирования и концентрирования градиента хлорида цезия проверьте концентрацию ДНК с помощью выбранного вами метода.

Затем еще раз проверьте целостность высокомолекулярной ДНК, взяв небольшой образец ДНК с помощью PFGE. Общее количество геномной ДНК, выделенной из двух граммов вынужденного грунта, колеблется от 10 до 180 мкг, как показано на прогоне геля до и после ультрацентрифугирования хлорида цезия. Диапазон размеров выделенной ДНК обычно колеблется от 40 до 60 килооснований. Здесь представлена хроматограмма образцов геномной ДНК до и после ультрацентрифугирования хлорида цезия.

Этот шаг улучшает чистоту ДНК, увеличивая соотношение двух 60 на два 80 с 1,3 до 1,6 до 1,8-1,9 впоследствии. Более того, пиковое поглощение на уровне 230 нанометров, что подразумевает загрязнение гуминовыми кислотами, было успешно снижено после центрифугирования. Мы только что показали вам, как выделить высокомолекулярную геномную ДНК из почвенных микробных сообществ.

При выполнении этой процедуры важно не забывать делать буфер для экстракции и денатурации в точном соответствии с инструкцией. И будьте осторожны, чтобы не добраться до неба ДНК после осаждения изопропилового спирта. Когда вы восстанавливаете полосу ДНК после центрирования хлоридного градиента.

Не забудьте промыть шприц с помощью TE, чтобы максимально восстановить ДНК. И, наконец, проверить количество и качество вашей выделенной ДНК на всех предложенных этапах. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте.