Электропрядения Волокнистые Строительные леса Полимер для тканевой инженерии и клеточной культуры

В данном видео демонстрируется электроспиннинг полимеров — популярный метод тканевой инженерии и культивирования клеток, используемый для создания волокнистых каркасов, имитирующих архитектуру и масштаб нативного внеклеточного матрикса. Здесь мы осуществляем электроспиннинг фотореактивной гиалуроновой кислоты, способной к сшиванию под воздействием света, и представляем дополнительные методы обработки, такие как фотопаттернирование — процесс создания каналов, каркасов и многомасштабной пористости для улучшения инфильтрации клеток и распределения ткани. Кроме того, мы используем метод формирования мультиполимерных каркасов, который позволяет наносить два разных полимера на один и тот же мат, что дает возможность регулировать механические свойства и скорость деградации каркаса, а также адаптировать пористость для обеспечения инфильтрации клеток.

Здравствуйте, я Джейми Кови из лаборатории Джейсона Бердика на кафедре биоинженерии Пенсильванского университета. Здравствуйте, я Харини Свин, также из лаборатории Бердика. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру электроспиннинга волокнистых каркасов для тканевой инженерии.

Мы также представим дополнительные возможности обработки: фотолитографическое создание паттернов и формирование многополимерных каркасов. Мы используем эти процедуры в нашей лаборатории для изучения взаимодействий и инфильтрации клеток HMSE в каркасы из гиалуроновой кислоты. Кроме того, данные методы применяются нами с различными другими полимерами для изучения тканей, армированных волокнами, таких как мениск и миокард.

Итак, приступим. Приготовьте 0,5% вес. раствор фотоинициатора. Я использую Irgacure 2959 (I 2959), растворяя его в деионизированной воде при температуре 37 °C в течение нескольких дней.

I cure используется в случаях, когда для электроспиннинга требуется фотореактивный полимер. Для приготовления раствора для электроспиннинга смешайте в деионизированной воде до конечных концентраций 2% вес. метилированной гиалуроновой кислоты (MEHA), 3% вес. полиэтиленоксида (PEO) и 0,05% вес. раствора I 2 9 5 9, перемешайте на вортексе в течение пяти минут и инкубируйте при 37 °C в течение ночи. Чтобы гомогенизировать раствор, перенесите его в шприц и закрепите на конце тупоконечную иглу 18-го калибра длиной шесть дюймов.

Затем используйте шприцевой насос, установив скорость подачи 1,2 milliliters per hour. Вставьте иглу шприцевого привода в шприцевой насос. Подключите заземленный вывод источника высокого напряжения к collecting apparatus.

В данной процедуре мы будем использовать оправку, вращающуюся со скоростью около 10 meters per second. Для сбора ориентированных волокон подсоедините положительно заряженный провод к игле, затем отрегулируйте положение иглы или собирающего устройства так, чтобы расстояние между ними составляло 15 centimeter. Запустите подачу шприцевого насоса и, как только жидкость появится на кончике иглы, включите источник питания и установите напряжение 22 kilovolts.

Собирайте волокна на каркас до достижения желаемой толщины. Время сбора зависит от требуемой толщины и объема используемого раствора для электроспиннинга. Для фотолитографического структурирования мы используем маты, полученные методом электроспиннинга в течение 16 часов.

После завершения сбора извлеките каркас из collecting apparatus и храните его под вакуумом в течение ночи для полного удаления растворителя. Вырежьте из мата каркаса образцы размером 5 мм на 5 мм с помощью ножниц. Поместите каждый каркас на стеклянный предметное стекло, покрытое фольгой, для подготовки к сшивке; наложите фотошаблон непосредственно на каркас, прикрыв его чистым предметным стеклом и закрепив оба конца стекла зажимами для бумаг.

Используя азотную камеру, продуйте скаффолд, чтобы предотвратить снижение степени сшивания из-за воздействия кислорода. Поместите установку со скаффолдом в азотную камеру под воздействие света с длиной волны 365 нанометров и мощностью около 10 милливатт на квадратный сантиметр с использованием коллимирующего адаптера в течение пяти минут. Извлеките каждый скаффолд и перенесите его в 12-луночный планшет для культивирования тканей.

Добавьте по два миллилитра деионизированной воды в каждую лунку. Тщательно заполните лунки планшета, чтобы предотвратить испарение воды, и поместите его в термостат при температуре 37 °C на 24 часа. Заменяйте воду каждые восемь часов, используя вакуумную пипетку для аспирации деионизированной воды из лунок между промывками.

Приготовьте 5% по массе раствор PEO в 90% этаноле на магнитной перемешивающей плитке. Перемешивайте при 700 RPM и 50 °C в течение не менее двух часов до начала процедуры. После перемешивания добавьте DPI до конечной концентрации 10 µg/mL.

Перенесите раствор PEO и DPI в шприц объемом 3 мл и оберните его алюминиевой фольгой для защиты от света. Затем приготовьте раствор для электроспиннинга, описанный во втором разделе, и с помощью микропипетки добавьте methoxy ethyl biocarbon mole rod domine B до конечной концентрации 25 µM в шприц объемом 3 мл. Оберните его алюминиевой фольгой для защиты от света.

Осторожно закрепите края покровных стекол из метилированного стекла размером 22 мм на 22 мм к поверхности мандрена с помощью клейкой ленты так, чтобы покровные стекла располагались по окружности мандрена. Используя силиконовую трубку длиной 5 мм, подсоедините один её конец к одному из шприцев с соединением Luer-Lock. Другой конец трубки подсоедините к игле, поместите шприц в шприцевой насос и проденьте иглу через отверстие в вентиляторе.

Распределители перемещаются вдоль стержня и используются для обеспечения равномерного распределения обоих полимеров в полученном скаффолде. Убедитесь, что кончики игл для шприца с MEHA центрированы относительно стержня. Расположите кончик иглы на расстоянии 15 сантиметров от стержня и установите распределитель на расстоянии шести сантиметров от кончика иглы.

Запрограммируйте шприцевой насос на подачу 1.2 milliliters в час и установите напряжение источника питания на 22 kilovolts. Подготовьте шприц с PEO точно таким же образом, но расположите кончик иглы на расстоянии 10 centimeters от мандреля и установите напряжение источника питания на 15 kilovolts. После этого выключите свет и включите мандрель и шприцевые насосы.

Снимите алюминиевую фольгу со шприцев, когда жидкость станет видна на кончиках обеих игл. Одновременно включите источники питания и подключите вентиляторы, когда сбор будет завершен. Выключите источники питания и оправу, затем осторожно отключите вентиляторы.

Удалите покровные стекла и клейкую ленту с помощью лезвия бритвы. Волокна можно визуализировать на флуоресцентном микроскопе, оснащенном фильтрами для румина и dpi. Поместите каждое покровное стекло с прикрепленным электроспиннинг-полимером в отдельную лунку шестилуночного планшета.

Планшет для микротитрования. Инкубируйте скаффолды в 2 мл PBS в течение ночи, чтобы обеспечить полное удаление растворителя и загрязнений. Через 24 часа с помощью вакуума аспирируйте PBS из лунок планшета, затем поместите скаффолды под бактерицидную УФ-лампу в ламинарном боксе на 30 минут. Для стерилизации выполните стандартные процедуры культивирования клеток и подготовьте концентрированную клеточную суспензию с требуемой плотностью клеток.

Например, используйте 100 миллилитров суспензии клеток для покровного стекла размером 22 на 22 миллиметра. Поместите в инкубатор на один час. Добавьте в каждое соответствующее количество среды для культивирования клеток.

Поместите скаффолды обратно в инкубатор. Окрасьте клетки с помощью имеющегося в продаже набора для определения жизнеспособности клеток (live/dead kit) от Invitrogen для визуализации клеток и волокон с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного фильтрами для TRITC и FITC. В ожидании скаффолды, собранные на заземленной плоской пластине, будут иметь случайное распределение волокон, в то время как скаффолды, собранные на вращающемся мандареле, будут иметь выровненные волокна.

Для получения выровненных волокон при просмотре с помощью сканирующей электронной микроскопии в процессе фотосшивке скаффолда мы помещаем фотомаску между скаффолдом и источником света после погружения скаффолда в деионизированную воду с нереактивным ha. В областях, закрытых от света, PEO удаляется, и мы наблюдаем образование макропор, что подтверждается флуоресцентным красителем. Одновременное электропрядение струй MEHA и PEO приводит к созданию композитного скаффолда, содержащего отдельные популяции волокон, состоящие из индивидуальных полимеров.

HMC, по всей видимости, положительно взаимодействуют с волокнами. Они не только остаются жизнеспособными, о чем свидетельствует зеленое окрашивание, но и, судя по всему, ориентируются таким образом, чтобы располагаться вдоль красных волокон. Мы только что продемонстрировали вам способ электроспиннинга волокнистых каркасов для тканевой инженерии.

Мы также внедрили дополнительные возможности, такие как фотолитографическое формирование рисунка и многокомпонентное электроспиннинг полимеров. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости оптимизировать параметры электроспиннинга для каждого полимера с целью получения однородных волокон перед началом любых последующих экспериментов. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.