Препарирование 6,5 Эмбрионы DPC мышь

Меня зовут Келли Ши, я менеджер лаборатории, а также исследователь-техник в лаборатории Нильсена. Это довольно сложная задача, так как многие люди не знают, как различать разные слои тканей. Поэтому вам необходимо фактически снять все слои тканей, чтобы обнажить лежащий под ними эмбрион, который на данном этапе еще не очень васкуляризирован. Он очень прозрачен, и его трудно различить.

Возьмите тупые пинцеты и ножницы. Первым делом зажмите ткани животного строго по срединной линии и сделайте первый разрез. Затем в этой точке просто раздвиньте кожу, обнажив брюшную полость животного.

С помощью пинцета приподнимите тонкий слой брюшины, затем разрежьте его ножницами и отогните в сторону. Сделайте разрез вдоль живота животного и разведите в стороны оба рога матки, которые соединены посередине. Разрез можно сделать прямо у основания.

Скорее всего, вместе с этим вы захватите большое количество жира. Возьмите весь рог матки животного и поместите его непосредственно в PBS.

Вот рог. Это места имплантации: 1, 2, 3, 4, 5. Вам нужно просто разделить их.

Здесь можно сделать разрез между местами имплантации. Просто захватите эмбрион сбоку и аккуратно раздвиньте ткани. Таким образом вы обнажите децидуальную оболочку, представляющую собой более губчатую ткань, расположенную под ними.

Таким образом, эмбрион должен находиться точно посередине, вот здесь. Это верхушка семядоли. Расположите его так, чтобы верхушка была обращена вверх.

В итоге вам потребуется отсечь примерно одну пятую часть от верхушки. Эмбрион должен располагаться точно посередине, прямо здесь. Я ориентирую его боком, захватываю одной парой пинцета, придерживаю другим, отрезаю кончик и затем отделяю его.

После снятия крышки установите эмбрион на ребро. Как видите, в месте, где была удалена крышка, есть отверстие. Просто введите туда пинцет. Да.

На данном этапе эмбрион очень неплотно зафиксирован в деуме. Как только вы раскроете деум, вы сможете достаточно легко извлечь его, если подденете его снизу у основания. Он очень маленький.

Также к эмбриону по-прежнему прикреплены некоторые ткани. Здесь, на вершине эмбриона, находится эктоплацентарный конус. Кроме того, прикреплены и другие ткани.

Теперь я просто беру пипетку и забираю его. На этом этапе необходимо зафиксировать эмбрионы, поэтому у меня подготовлена чашка с PFA.

Мы хотели изучить гены-кандидаты. В целом мы используем методы гибридизации РНК in situ на целых препаратах для визуализации продукции нуклеиновых кислот in situ внутри эмбриона. Эти конкретные гены, которые нас очень интересуют, кодируют предполагаемые маркеры клеток-предшественников зародышевых клеток; также предполагается, что они экспрессируются в эмбрионе мыши в определенный момент времени, что способствует развитию и созреванию предполагаемых предшественников в полноценные зародышевые клетки.

Одним из таких факторов, который нас в первую очередь заинтересовал и по которому мы первым делом провели гибридизацию in situ на всем эмбрионе на стадии 6,5 суток, был костный морфогенетический белок 4, BMP4. Он является представителем суперсемейства TGF-beta. Этот белок крайне важен и абсолютно необходим для созревания зародышевых клеток.

Также необходимо, чтобы половые клетки перемещались по всему эмбриону и располагались рядом с примитивной полоской эмбриона. BMP4 играет критическую роль как в передаче сигналов, так и в созревании половых клеток, которое необходимо для их размещения в примитивной полоске. Поэтому вам следует, во-первых, четко понимать, что именно вы ищете, знать размер объекта и масштаб, в котором вы работаете, а также очень тщательно все спланировать.

Особенности методики, особенно в отношении того, какой именно стереомикроскоп вы будете использовать. Одна из технических сложностей заключается в том, что процедура требует множества манипуляций и очень точных, уверенных движений рук, чтобы не повредить эмбрион. Поэтому следует выбрать стереомикроскоп, обеспечивающий достаточное пространство для работы; также убедитесь, что все необходимые для эксперимента материалы подготовлены заранее, чтобы свести к минимуму количество лишних манипуляций в процессе диссекции.

Помимо этого, я считаю, что необходимо действовать очень медленно и крайне осторожно снимать отдельные слои тканей, чтобы четко понимать, с чем вы работаете. Также убедитесь, что вы точно определили положение эмбриона.