Внутриядерных микроинъекции ДНК в диссоциированных взрослых млекопитающих Нейроны

На первом этапе этой процедуры инъекции рабочая концентрация раствора ДНК центрифугируется в осадок. Пипетки для впрыска твердых частиц, изготовленные из капиллярной трубки из силикатного стекла BO, затем заполняются раствором ДНК. Клетки помещаются на предметный столик под микроскопом и оптимизируется визуализация клеточного ядра.

Пипетка выравнивается с ядром, и клетка вводится. На следующий день в каждую чашку вводится несколько клеток. Успешно введенные клетки идентифицируются по экспрессии репортерного гена.

Здравствуйте, я Ван Му из лаборатории доктора Стивена Акеды в Национальном институте злоупотребления алкоголем и алкоголизма при Национальном институте здравоохранения. Меня зовут Дэмиен Уильямс, я тоже из лаборатории Акеда. А я Юджин, управляемый из лаборатории АКЕДА.

Сегодня мы покажем вам процедуру микроинъекции INTERCLEAR конструкций CDNA в диссоциированные нейроны. Это эффективный метод гетероэкспрессии представляющих интерес белков в постмитотических клетках, которые традиционно трудно трансфицировать. Мы используем эту технику в нашей лаборатории для изучения механизмов, лежащих в основе модуляции G-белка в N-каналах.

Итак, давайте получим темные зубы. Начните с нанесения диссоциированных нейронов взрослых млекопитающих на чашки для клеточных культур, покрытые 0,1 миллиграмма на миллилитр высокомолекулярного поли-L-лизина. Это способствует адгезии нейронов к нижней поверхности посуды.

Цилиндры для клонирования стекла могут быть использованы для концентрации покрытых нейронов в меньшей, более ограниченной области. Чтобы свести к минимуму расстояние между вводимыми нейронами. Поместите чашки в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на три-шесть часов перед выполнением внутриядерных микроинъекций, чтобы дать достаточно времени для прилипания клеток к дну посуды.

Во время инкубации нейронов пипетки для микроинъекций готовятся с использованием пуллера Sutter P 97 огненно-коричневого цвета и тонкостенных капиллярных трубок из силикатного стекла Боро. Мы используем двухступенчатую программу pull со следующими настройками для pull one и для pull two. Поскольку требуемые настройки варьируются в зависимости от партии стекла и в зависимости от состояния нагревательной нити в съемнике, их следует регулировать по мере необходимости.

По крайней мере, пять инъекционных пипеток должны быть извлечены на чашку нейронов в случае, если пипетки будут повреждены или возникнут проблемы во время сеанса инъекции. Вытянутые инъекционные пипетки следует хранить в закрытом контейнере, чтобы предотвратить попадание пыли на наконечник микроинъекционной пипетки непосредственно перед инъекцией плазмидных CDNA до рабочей концентрации. Положите небольшой кусочек параформы на рабочую поверхность и снимите бумажную подложку.

Добавьте в параметр стоковый раствор CD NA и буфер TE. Чтобы разбавить CD NA, мы рекомендуем использовать конечную концентрацию CDNA менее 200 нанограммов на микролитр и общий объем от двух до 10 микролитров. Если белок, кодируемый CD NA, не помечен репортерной плазмидой, например, EGFP может быть введен совместно с экспериментальным CD NA.To подтверждения успешной инъекции и экспрессии, смешивать растворы CD NNA путем пипетирования вверх и вниз несколько раз на перфиле.

Будьте осторожны, чтобы не допустить попадания пузырьков воздуха, чтобы в растворе кДНК оседали частицы, которые впоследствии могут заблокировать микроинъекционную пипетку. С помощью наконечника для дозатора с микрозагрузкой переложите его на подготовленную пробирку для гематокрита, которая была очищена, разрезана и запечатана пламенем с одного конца. Затем поместите пробирку с гематокритом в микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитра и вращайте в течение 15-30 минут.

10 000 GS при комнатной температуре. После завершения центрифугирования отложите в сторону пробирку с раствором для инъекций кДНК. Раствор можно хранить при комнатной температуре во время сеанса инъекций в течение одного-двух часов.

После нанесения покрытия ячеек снимите стекло с цилиндров клонирования. Затем верните пластинчатые клетки в инкубатор на оставшуюся часть инкубационного периода до сеанса инъекции. Чтобы начать инъекцию, сначала возьмите чашку с пластинчатыми нейронами из инкубатора и поместите ее на столик микроскопа установки для инъекций.

Установка состоит из инвертированного фазово-контрастного микроскопа, инжектора давления, подключенного к микромному манипулятору, и системы видеонаблюдения. При фазовом контрасте нейроны выглядят как сферические клетки с хорошо видимым ядром в виде центральной круглой органеллы с темной мембраной и могут содержать одно или несколько ядрышек. С помощью наконечника для пипетки микрозагрузчика наберите два микролитра подготовленного CD NA из гематокритной пробирки.

Будьте осторожны, избегайте раствора на дне пробирки, где могли оседать частицы. Переложите раствор в пипетку для микроинъекций. Нить накала в пипетке для микроинъекций должна помочь в подтягивании раствора к кончику.

Но если мелкие пузырьки воздуха сохраняются, осторожно поверните боковую сторону стекла, чтобы сместить их, убедитесь, что капиллярный держатель инжектора давления зафиксирован под углом 45 градусов. Затем вставьте пипетку для микроинъекций в капиллярный держатель и закрепите держатель на микроманипуляторе. Затем опустите пипетку для микроинъекций в чашку с помощью микром-манипулятора, когда пипетка входит в культуральную среду, образуется мениск, который изменяет путь света через образец и, таким образом, снижает качество изображения нейронов.

Чтобы облегчить эту проблему, отрегулируйте фазовую турель до тех пор, пока ядра нейронов не станут четко видны. Перед началом инъекций. Используйте функцию очистки системы впрыска под давлением, чтобы очистить пипетку от мусора и проверить качество пипеток для микроинъекций.

Выброшенный раствор должен быть виден на экране. При использовании этой функции жидкость из наконечника для дозатора оптимального размера выбрасывается тонкой струйкой. Если пипетка для микроинъекций забита или слишком узкая, она не будет выбрасывать жидкость при использовании функции очистки.

Если наконечник слишком широкий или был сломан, жидкость будет выбрасываться из наконечника широкой струей. Если наконечник выглядит неоптимальным во время инъекций, замените пипетку для инъекций, теперь центрируйте пипетку для микроинъекций на мониторе просмотра. Удерживая ядро в фокусе, опустите кончик пипетки до тех пор, пока он не окажется в фокусе рядом с нейроном.

Установите это положение в качестве нижнего предела оси Z на микроманипуляторе. Это положение представляет собой глубину, на которую будет продвигаться пипетка для микроинъекций во время инъекций. Далее расположите кончик примерно на 30 микрометров выше этой точки.

Таким образом, пипетка для микроинъекций очищает верхнюю часть нейронов. Теперь запрограммируйте настройки микром манипулятора для микроинъекций. Установите режим инжекции микромального манипулятора Эйнора в положение вкл., а функцию пронзания в положение Выкл, чтобы свести к минимуму повреждение клеток.

Во время микровпрыска обозначьте диагональную траекторию впрыска, выбрав осевой режим. Установите скорость впрыска на 300 микрометров в секунду и синхронизируйте нарастание давления на пределе. Следующая программа.

Настройки напорного инжектора устанавливают давление впрыска или PI в диапазоне от 100 до 200 Гектора Паскалей или HPA, продолжительность впрыска или ti равна 0,3 секунды и компенсационное давление PC на 30 HPA. После того, как настройки манипулятора отрегулированы, можно проводить внутриядерные инъекции. Используя положение управления столиком по оси XY микроскопа, нейрон под кончиком пипетки для микроинъекций.

Выровняйте кончик пипетки над центром ядра, фокусируясь вверх и вниз между кончиком и залегающим ядром. Введите ядро, нажав кнопку инъекции на микроманипуляторе. Впрыск имеет относительно низкую вязкость.

Раствор CDNA часто проявляется в виде белого шлейфа в ядре. При рассмотрении в условиях фазово-контрастной оптики. Продолжайте вводить нейроны, изменяя положение предметного столика микроскопа, чтобы выровнять следующий нейрон под пипеткой для микроинъекций.

Систематически перемещайтесь по блюду. Продолжение введения ядер. Используйте описанную ранее функцию очистки каждые 10–15 инъекций, чтобы проверить качество пипетки для микроинъекций.

Если пипетка забита или повреждена, замените ее на новую инъекцию. Неровности пипетки на нижней поверхности чашек для культуры тканей могут привести к тому, что пипетка для инъекций пропустит клетку или не позволит белому шлейфу быть видимым в ядре. В таких случаях просто отрегулируйте наконечник пипетки для микроинъекций в той же плоскости фокусировки, что и ядро, и установите его в качестве нового предела по оси X.

Затем продолжайте вводить нейроны. Иногда пипетка для микроинъекций не проникает через ядерную мембрану и просто подталкивает ядро. Если это произойдет, то повторная попытка инъекции в ту же позицию может привести к успешной инъекции ДНК в ядро.

Набухание клетки обычно указывает на непреднамеренную цитоплазматическую инъекцию. После того, как будет введено от 50 до ста ядер, верните чашку с нейронами в инкубатор для ночной инкубации. Через 16 часов успешно введенные нейроны могут быть идентифицированы по экспрессии репортерного гена.

В этой области был введен один верхний шейный ганглий или нейрон SCG, который может быть идентифицирован по экспрессии EGFP. Неинъецируемые SCG-нейроны, которые не имеют эндогенного G-белка, связанного внутрь выпрямляющими калиевыми или grk-каналами, не дают измеримых токов во время нарастания напряжения. При воздействии норадреналина, связанного с G-белком, агонистом норадреналина, для сравнения, при успешном впрыске плазмидного кодирования CD NA, функциональный канал grk дает начало большим токам во время нарастания напряжения при воздействии норадреналина.

Измеренные здесь токи типичны для каналов Кирка и характеризуются активацией путем внутренней выпрямления норадреналина и ингибированием предполагаемым блокатором каналов grk. Барий, Мы только что показали вам, как вводить CD NA в ядро нейронов. При выполнении этой техники важно помнить четыре вещи.

Во-первых, раскрутить ДНК перед инъекцией. Во-вторых, чтобы убедиться, что ядро хорошо видно. В-третьих, чтобы отрегулировать предел оси Z при навигации по блюду.

И в-четвертых, регулярно проверять качество бодрящего наконечника между инъекциями. Так что спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте.