Подготовка эмбрионов для электронной микроскопии Drosophila Эмбриональные трубки сердца

В этом видео объясняется, как выполнять просвечивающую электронную микроскопию, также известную как TEM, эмбрионального сердца дрозофилы. Сердце стало ценной модельной системой для изучения миграции клеток, межклеточной адгезии и изменений формы клеток. Данный метод позволяет визуализировать форму просвета сердца, а также ультраструктурные компоненты, такие как клеточные мембраны, межклеточные контакты и базальная мембрана.

Для начала данной процедуры готовится фиксирующий раствор, подходящий для трансмиссионной электронной микроскопии эмбрионов дрозофилы. Затем в фиксирующий раствор помещают собранные эмбрионы в возрасте от 0 до 20 часов. По завершении эмбрионы извлекают из фиксирующего раствора и обрабатывают, закрепив их на двусторонней клейкой ленте.

В чашке Петри с деионизированным буфером плавают эмбрионы, которые затем собирают с помощью пипетки. После этого эмбрионы фиксируют и подвергают воздействию градиента дегидратации. После инфильтрации смолой их переносят в форму для заливки, где выравнивают.

Полученный блок разрезают с помощью алмазного ножа. Срезы переносят на медные сетки, окрашивают и исследуют. Здравствуйте, я Надин Лоп из лаборатории Суниты Крамер на кафедре патологии и лабораторной медицины Медицинского университета Нью-Джерси при медицинской школе Роберта Вуда Джонсона.

Меня зовут Радж Патель. Я специалист по электронной микроскопии из отделения патологической анатомии PON. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру подготовки и визуализации эмбрионов oph для трансмиссионной электронной микроскопии.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения морфогенеза сердца Drosophila. Итак, приступим.

Перед началом работы с эмбрионами дрозофилы свежеприготовьте фиксирующий раствор для метода фиксации эмбрионов путем проницаемости гептана. В вытяжном шкафу перенесите пипеткой 2 mL свежеприготовленного раствора 12.5% глутаральдегида в буфере Кейта в стеклянный флакон для сцинтилляции. Добавьте 8 mL гептана ADA и интенсивно встряхните.

Затем подождите одну минуту. После разделения двух фаз верхний слой будет содержать гептан ADA, насыщенный глутаральдегидом, который и является фиксирующим раствором. Перенесите верхнюю фазу пипеткой в чистый флакон и отставьте в сторону. Для сбора эмбрионов в возрасте от 0 до 20 часов используйте камеру для сбора эмбрионов, которая представляет собой небольшую корзинку со съемным сетчатым вкладышем.

Начните с извлечения чашки с виноградным соком, содержащей эмбрионы, и удалите всех погибших мух. Затем, используя воду и кисть, отделите эмбрионы от поверхности чашки с виноградным соком и перенесите их в камеру для сбора эмбрионов с помощью сквирт-бутылки с водой.

Промойте эмбрионы, чтобы удалить излишки дрожжей с чашки с виноградным соком. Удалите внешнюю мембрану хориона, выдержав эмбрионы в 50% растворе отбеливателя от двух до трех минут или до тех пор, пока эмбрионы не всплывут на поверхность. Тщательно промойте дистиллированной водой и просушите эмбрионы на бумажном полотенце.

С помощью пинцета извлеките сетчатый вкладыш, который теперь должен быть покрыт окрашенными эмбрионами. Поместите вкладыш в фиксатор, позволяя эмбрионам упасть с сетки. Фиксируйте эмбрионы в течение полутора часов при температуре 4 °C при перемешивании на орбитальном шейкере.

По завершении инкубации перенесите эмбрионы в чашку Петри, дно которой выстлано двусторонним скотчем, стараясь захватить как можно меньше фиксатора. Встряхните чашку, чтобы распределить эмбрионы в один слой, затем поместите ее в вытяжной шкаф для испарения гептана. После высыхания эмбрионов залейте их буфером, содержащим 0,1% tween hand de vize.

Эмбрионы на поздней стадии 16 под диссекционным микроскопом с использованием тупой вольфрамовой иглы. Эмбрионы, которые были отделены, всплывают, и их можно собрать с помощью пастуральной пипетки; перенесите эмбрионы в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Промойте эмбрионы в 0,1 М САТЕ-буфере, а затем проведите постфиксацию в 1% растворе тетраоксида осмия в течение одного часа при комнатной температуре.

После инкубации промойте эмбрионы буфером Cate. Снова проведите дегидратацию эмбрионов в градуированном ряду этанола и ацетона. Начните с 50% ethanol в течение 10 минут, затем 70% Ethanol в течение 10 минут, после чего проведите дегидратацию в 90% acetone в течение 10 минут и, наконец, в 100% acetone с интервалами по 10 минут.

Удалите ацетон. Начните процесс инфильтрации, добавив смесь спрей-смолы ein и ацетона в соотношении один к одному. Убедитесь, что образец находится под вакуумом, и подвергните его воздействию микроволнового излучения в течение трех минут.

Поддерживайте вакуум еще пять минут. Замените смесь смолы с ацетоном 100% смолой и снова подвергните воздействию микроволнового излучения под вакуумом. Замените смолу и подвергните воздействию микроволнового излучения под давлением.

Повторите процедуру в последний раз, чтобы общее количество этапов инфильтрации составило три. Перенесите эмбрионы из микроцентрифужной пробирки в силиконовую форму для заливки. Выровняйте эмбрионы в ряд таким образом, чтобы их задний конец был ориентирован вдоль сужающегося края формы.

Бекон выдерживают в печи при температуре 70 °C в течение ночи. Затем полученный блок извлекают для изготовления срезов. С помощью микротома делают срезы толщиной 1 мкм через эмбрионы.

Когда блок будет полностью разрезан и эмбрион будет достигнут, с помощью петли перенесите отдельный срез на предметное стекло, чтобы определить, достигнута ли необходимая глубина для визуализации сердца перед началом основного наблюдения. Кратковременно прогрейте срез на нагревательном столике и окрасьте его метиленовым синим, предварительно добавив одну каплю красителя на стекло, после чего снова кратковременно прогрейте.

Снова промойте деионизированной водой и изучите срез под микроскопом на нужной глубине секционирования. Для соблюдения ограничений по пространству просвет сердца должен быть различим при использовании светового микроскопа. Повторно подрежьте блок так, чтобы в поперечном сечении было максимум пять эмбрионов, у которых видно эмбриональное сердце.

С помощью микротома изготовьте срезы толщиной 90 нанометров. Перенесите несколько срезов на медную сетку. Окрасьте сетку 3% раствором ацетата алюминия в течение 10 минут, затем трижды промойте дистиллированной водой.

Теперь окрасьте сетку цитратом свинца в течение двух с половиной минут в камере с гранулами гидроксида натрия для создания среды, свободной от диоксида углерода. После инкубации трижды промойте дистиллированной водой. Исследуйте срезы с помощью электронного микроскопа при 80 киловольтах и сфотографируйте с помощью ПЗС-камеры.

Для того чтобы определить, правильно ли были выполнены глубина среза и стадирование, должно быть очевидно, что между двумя кардиобластами дорсальной срединной линии сформировался просвет зрелого сердца; чтобы определить, сохранны ли клеточные мембраны, исследуйте просвет сердца на наличие внеклеточного матрикса, а также ищите присутствие крист и митохондрий. Таким образом, мы продемонстрировали вам способ определения ультраструктуры эмбрионального сердца Drosophila. При выполнении данной процедуры.

Важно помнить о необходимости правильного определения стадии развития эмбрионов дрозофилы, а также точного измерения компонентов смолы и их тщательного перемешивания. Благодарим за просмотр и желаем удачи в проведении вашего эксперимента.