Подготовка эмбрионов для электронной микроскопии Drosophila Эмбриональные трубки сердца

В этом видео объясняется, как проводить просвечивающую электронную микроскопию, также известную как ПЭМ, на эмбриональной тележке дрозофилы. Сердце стало ценной модельной системой для изучения миграции клеток, адгезии клеток и изменений их формы. Этот метод позволяет визуализировать форму просвета сердца, а также ультраструктурные компоненты, такие как клеточные мембраны, клеточные соединения и базальная мембрана.

Чтобы начать эту процедуру, готовят фиксирующий раствор, подходящий для просвечивающей электронной микроскопии эмбрионов дрозофилы. Затем в фиксирующий раствор помещают коллекцию эмбрионов с оболочкой от нуля до 20 часов. По завершении эмбрионы извлекаются из фиксирующего раствора и прикрепляются к двустороннему скотчу.

В чашке Петри, содержащей буфер, деионизированные эмбрионы плавают в буфере и извлекаются с помощью пипетки. Затем эмбрионы постфиксируются и подвергаются градиенту обезвоживания. После пропитки смолой они переносятся в форму для закладки, где выравниваются.

Полученный блок разрезается алмазным ножом. Срезы подбирают на медных сетках, окрашивают и исследуют. Здравствуйте, я Надин Лоп из лаборатории Суниты Крамер на кафедре патологии и лабораторной медицины Университета медицины и стоматологии Нью-Джерси в Медицинской школе Роберта Вуда Джонсона.

Меня зовут Радж Патель. Я электронный микроскопист также из патологии PON. Сегодня мы покажем вам процедуру подготовки и визуализации эмбрионов oph для просвечивающей электронной микроскопии.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения морфогенеза сердца дрозофилы. Итак, давайте начнем. Приступайте.

Перед обработкой эмбрионов дрозофилы в свежем виде готовят фиксирующий раствор для гептанового проникающего метода фиксации эмбрионов. В вытяжной шкаф пипетку закапывают два миллилитра свежеприготовленного раствора, содержащего 12,5% глутаральдегида в буфере Кейта, в стеклянный сцинтилляционный флакон. Добавьте восемь миллилитров гептана ADA и энергично встряхните.

Затем подождите одну минуту. Позволяя двум фазам разделяться, верхняя фаза содержит гептан ADA, насыщенный глутаральдегидом, который является фиксирующим раствором. Пипеткой поместите верхнюю фазу в чистый флакон и отложите его в сторону Для сбора эмбрионов от нуля до 20 часов используйте камеру для сбора эмбрионов, которая представляет собой небольшую корзину со съемной сетчатой вставкой.

Начните с удаления тарелки с виноградным соком с эмбрионами и удалите всех мертвых мух. Затем с помощью воды и кисти. Отделите эмбрионы от тарелки с виноградным соком, перенесите эмбрионы в камеру сбора эмбрионов с помощью квадратной бутылки с водой.

Промойте зародыши от лишних дрожжей с пластины с виноградным соком. Удалите внешнюю мембрану кориона, замочив эмбрионы в 50% растворе отбеливателя на две-три минуты или пока эмбрионы не всплывут на поверхность. Тщательно промойте дистиллированной водой и выложите зародыши на бумажное полотенце.

С помощью щипцов подхватите сетчатый вкладыш, который теперь должен быть покрыт покрытыми оболочкой эмбрионами. Поместите вставку в фиксатор, позволив эмбрионам выпасть из сетки. Дайте эмбрионам закрепиться в течение полутора часов при температуре четыре градуса Цельсия, одновременно перемешивая на орбитальной коромысле.

Как только инкубация будет завершена, поместите эмбрионы в чашку Петри, выстланную двусторонним скотчем, забирая как можно меньше фиксатора. Встряхните чашку, чтобы распределить эмбрионы в один слой, а затем поместите ее в химический колпак, чтобы гептан испарился. После того, как эмбрионы высохнут, накройте эмбрионы буфером, содержащим 0,1% tween hand de vize.

Поздняя стадия 16 эмбрионов под препарирующим микроскопом тупой вольфрамовой иглой. Эмбрионы, которые были израсходованы, всплывают и могут быть восстановлены с помощью пастбищной пипетки, переносят эмбрионы в микропробирку объемом 1,5 миллилитров. Промойте эмбрионы в 0,1 молярном буфере, а затем постфиксируйте в 1% тетраоксиде осмия в течение одного часа при комнатной температуре.

После инкубации промойте эмбрионы буфером Кейта. Еще раз обезвоживайте эмбрионы в сортовом ряду этанола и ацетона. Начните с 50% этанола в течение 10 минут, затем с 70% этанола в течение 10 минут, затем обезвоживайте в 90% ацетона в течение 10 минут и, наконец, переходите на 100% ацетон по 10 минут каждый.

Удалите ацетон. Начните процесс инфильтрации с добавления смеси аэрозольной смолы и ацетона один к одному. Убедитесь, что образец находится под вакуумным давлением и разогрейте в микроволновой печи в течение трех минут.

Поддерживайте вакуумное давление еще пять минут. Замените смесь ацетонов смолы на 100% смолу и снова разогрейте в микроволновой печи под вакуумным давлением. Замените смолу и СВЧ под давлением.

Последний раз для трех этапов проникновения. Перенесите эмбрионы из микропробирки в силиконовую форму для встраивания. Выровняйте эмбрионы в ряд таким образом, чтобы задний конец эмбриона совпадал с коническим краем формы.

Бекон нагревается до 70 градусов Цельсия в духовке на ночь. Затем снимите образовавшийся блок для секционирования. С помощью микротома разрежьте срезы размером в один микрометр в эмбрионах.

После того, как блок будет разрезан и эмбрион будет достигнут, используйте петлю, чтобы переместить одну секцию на предметное стекло, чтобы определить, была ли достигнута надлежащая глубина для визуализации сердца до визуализации. Кратковременно нагрейте секцию на горячей плите и окрасьте секцию метиленовым синим, предварительно добавив каплю на предметное стекло. А затем кратковременный нагрев.

Снова промойте деионизированной водой и рассмотрите срез под микроскопом на нужную глубину среза. Просвет сердца должен быть узнаваем с помощью светового микроскопа, чтобы удовлетворить пространственные ограничения. Повторно обрежьте блок, чтобы включить максимум пять эмбрионов в поперечном сечении, которые показывают сердце эмбриона.

Вырежьте с помощью микротома срезы размером 90 нанометров. Возьмите несколько секций на медной сетке. Окрасьте сетку 3%-ным ацетатом на 10 минут, затем трижды промойте дистиллированной водой.

Теперь окрасьте сетку цитратом свинца на две с половиной минуты в камере, содержащей гранулы гидроксида натрия, чтобы создать среду, свободную от углекислого газа. После инкубации трижды промыть дистиллированной водой. Рассмотрите срезы с помощью электронного микроскопа при напряжении 80 киловольт и сфотографируйте с помощью ПЗС-камеры.

Для того, чтобы определить, правильно ли была выполнена глубина разреза и стадирование, должно быть очевидно, что между двумя кардиовсплесками дорсальной средней линии сформировался зрелый просвет сердца, чтобы определить, не повреждены ли клеточные мембраны, исследовать просвет сердца на наличие внеклеточного матрикса и искать наличие Кристи и митохондрий. Итак, мы только что показали вам, как определить ультраструктуру сердца эмбриона дрозофилы. При этом делать эту процедуру.

Важно помнить о правильной стадии эмбрионов дрозофилы, а также о точном измерении компонентов смолы и их хорошем смешивании. Так что спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте.