Измерение коэффициентов диффузии через двухфотонной флуоресценции Восстановление после фотообесцвечивания

Многофотонная флуоресценция. Восстановление после процедуры фотообесцвечивания легко продемонстрировать с помощью свободно диффундирующего образца молекул флуоресцентного красителя. Во-первых, лазерный луч низкой интенсивности направляется в образец для создания эталонного уровня флуоресценции из молекул D в фокусном объеме лазера.

Затем кратковременная лазерная вспышка высокой интенсивности посылается в фотообесцвечивание части молекул красителя в пределах фокусного объема. Наконец, лазерный луч ослабляется до прежнего низкого уровня интенсивности, и флуоресценция контролируется по мере того, как фотообесцвеченные молекулы диффундируют наружу и заменяются еще флуоресцентными молекулами из-за пределов фокального объема. Результирующая флуоресценция в зависимости от временной кривой анализируется для получения коэффициента диффузии.

Здравствуйте, я Келли Салливан из лаборатории Эдварда Брауна на факультете биомедицинской инженерии Университета Рочестера. Сегодня мы покажем вам, как выполнить восстановление многофотонной флуоресценции после фотообесцвечивания. Мы используем эту методику в нашей лаборатории для изучения диффузии в биологических системах in vitro и in vivo.

Итак, приступим. Для начала установите нужную длину волны лазера и вставьте соответствующий фильтр перед фотоумножителем или ФЭУ. Затем, чтобы избежать повреждения ячейки PCAL, отрегулируйте мощность лазера до 200 милливатт или меньше.

Перед ячейкой pcal расположены два зеркала, ориентированные в форме четыре штуки. Эти зеркала необходимы и достаточны для выравнивания лазерного луча через ячейку pcal. Установите смещение напряжения на контроллере смещения ячейки pcal в ноль, отрегулируйте траекторию лазера через ячейку pcal таким образом, чтобы лазер был центрирован в переднем и заднем окнах.

Используйте зеркало вверх по течению в цифре четыре для центрирования луча в переднем окне, а зеркало вниз по течению в цифре четыре — для центрирования луча в заднем окне. Теперь установите напряжение на кристалле ячейки pcal на максимальное значение. Соответствующее значение зависит от длины волны и может быть найдено в руководстве по эксплуатации ячейки pcal.

Отрегулируйте зеркала в виде цифры четыре перед ячейкой pcal до тех пор, пока выходная мощность ячейки pcal не станет максимальной. Теперь переключите напряжение на кристалле в ноль и отрегулируйте смещение напряжения на контроллере смещения, чтобы свести к минимуму выходную мощность от ячейки pcal. Верните мощность лазера, падающую на ячейку pcal, к значению, необходимому для эксперимента.

Теперь перейдем к микроскопу, чтобы получить хороший визуальный фокус на стандартизированном флуоресцентном образце. Здесь мы используем фиксированные флуоресцентные зерна пыльцы. После фокусировки запечатайте микроскоп, отрегулируйте мощность лазера до соответствующего уровня для визуализации образца, изменяя напряжение на кристалле PCAL-клетки.

Наконец, выключите свет и включите ФЭУ. Запустите повторное сканирование изображения стандартизированного образца и отрегулируйте зеркала ниже по потоку от ячейки PCAL до получения четкого изображения образца. Теперь давайте рассмотрим определение безопасных возможностей монитора, на которые люди сосредотачиваются в выборке.

Для целей этого видео мы будем использовать образец водного красителя, содержащийся в углублении в предметном стекле и закрытый покровным стеклом. Ослабьте лазер до низкой, но разумной мощности для генерации флуоресценции в образце. Запечатайте микроскоп, отведите выход от ФЭУ на счетчик фотонов.

Выключите свет, включите ФЭУ и начните точечное сканирование в программном обеспечении микроскопа. Настройте счетчик фотонов на интеграцию в масштабе времени, значительно превышающем ожидаемое время восстановления флуоресценции, и запишите разумное количество точек данных. Увеличьте мощность и возьмите еще одну серию данных о подсчете фотонов.

Продолжайте увеличивать мощность до тех пор, пока увеличение количества фотонов не станет значительно уменьшаться. Что касается графика увеличения мощности, логарифм фотонов считается функцией логарифма мощности. Любое отклонение от уклона в два указывает на обесцвечивание.

Во время монитора выберите разумную мощность монитора, которая будет ниже этого предела. Теперь определимся с входными параметрами к многоканальному скейлеру и генератору импульсов. На генераторе импульсов.

Установите время предварительного обучения в один-два раза больше, чем ожидаемое время половинного восстановления, а время отбеливания — в одну десятую от ожидаемого времени восстановления на скейлере. Установите ширину лотка примерно равной половине продолжительности отбеливания и установите количество контейнеров на запись таким образом, чтобы произведение выбранной ширины контейнера и контейнеров на запись было больше ожидаемого полного времени восстановления. Плюс значения предварительного и отбеливающего значений возвращаются к генератору импульсов и устанавливают частоту последовательности предварительного и отбеливающего веществ, равную значению, которое чуть меньше обратного произведения ширины ячейки на количество ячеек на запись.

Наконец, установите количество записей за сканирование на скалере в зависимости от интенсивности сигнала при выбранной мощности монитора. Теперь установите мощность монитора на безопасный уровень и установите мощность отбеливателя примерно на 200 милливатт выше порогового значения отбеливания, определенного во время испытания монитора на обесцвечивание. Обе эти мощности установлены в виде различных напряжений на кристаллическом уплотнении al-клеток, микроскоп выключает свет.

Включите ФЭУ. Начните точечное сканирование в программном обеспечении для обработки изображений. Затем запустите генератор импульсов и скейлер.

Чтобы проанализировать полученную кривую восстановления, отметьте три важных момента. Предварительная флуоресценция, флуоресценция сразу после обесцвечивания и флуоресценция в конце набора данных. Используйте значения флуоресценции до и сразу после отбеливания, чтобы лучше оценить время половинного восстановления.

Теперь используйте правила, описанные в предыдущих шагах, чтобы обновить значения длительности предварительного отбеливания и ширины начала. Возьмите новую кривую и продолжайте настраивать параметры до тех пор, пока полученная кривая не покажет сильное обесцвечивание и плавное восстановление. Проверьте насыщенность возбуждения, построив график логарифма параметра глубины отбеливателя в зависимости от логарифма мощности.

Любое отклонение от угла в два указывает на насыщение возбуждения. Выберите мощность отбеливателя, которая дает сильный отбеливатель, но не вызывает насыщения. Наконец, определив соответствующие параметры, продолжайте восстановление многофотонной флуоресценции после фотообесцвечивания или кривых MP FP интересующего вас образца.

Теперь мы покажем репрезентативные результаты как необработанных данных MP frap, так и нормализованных кривых обёртывания MP F, которые были подогнаны, коэффициент диффузии, необработанные данные MP F frap, сильное обесцвечивание и плавное восстановление. При этом сообщается о полном восстановлении для второй половины данных, чтобы они соответствовали данным. Сначала мы нормализуем восстановление до средней предельной флуоресценции, а затем выполняем нелинейную подгонку арендованных квадратов.

Относительно соответствующей модели. Оба набора данных были взяты в водной среде флуоресцеина и коэффициентах диффузии выхода. В соответствии с литературой: мы только что показали вам, как выполнить восстановление многофотонной флуоресценции после эксперимента по фотообесцвечиванию.

При выполнении этой процедуры важно соблюдать осторожность и устанавливать параметры эксперимента, в частности, продолжительность отбеливания, а также мощности отбеливания и контроля в безопасных пределах, определенных в протоколе. Так что спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.