Живая Препарирование Drosophila Эмбрионы: Упрощенная методы скрининга Мутант Коллекции антител Окрашивание

Здесь мы видим процедуру сбора эмбрионов. Переложите мух из флаконов в пробирки пятиствольной сборной камеры. Затем поставьте на камеру виноградную тарелку для винограда и дайте мухам отложить яйца в течение нескольких часов.

Когда зародыши окажутся на нужной стадии, переложите их из виноградного аате на двойной клейкий скотч с помощью кисти. Теперь раскатайте эмбрионы из их конов и выстройте их на агаровом блоке их брюшными сторонами. В центре мы видим предметное стекло с прямоугольником из воска и куском двойной клейкой ленты На одном конце переверните двойную клейкую ленту над блоком с выстроенными эмбрионами и прикоснитесь ею к эмбрионам, чтобы перенести их на предметное стекло.

Теперь они сразу будут лежать спинной стороной вверх. Добавьте PBS на область предметного стекла, окруженную восковым прямоугольником, чтобы покрыть эмбрионы. В верхней части показан вид слайда сбоку, а в нижней — вид сверху.

Стеклянной иглой для рассечения сделайте надрез вдоль мембраны вииля. Проткните эмбрионы в области мозга, поднимите их вверх и переместите рядами на стекле. Затем препарируйте каждый зародыш, чтобы получилось филе.

В конце процедуры у вас будет предметное стекло с рядами филе эмбрионов. Теперь он готов к исправлению. Здравствуйте, меня зовут Питер Ли, я работаю в лаборатории Кайдзен на биологическом факультете Калифорнийского технологического института.

Здравствуйте, я Эшли Райт, аспирант Калифорнийского технологического института в лаборатории Кайдзен. Я Кайдзен, профессор Калифорнийского технологического института, и моя исследовательская группа занимается развитием нервной системы у плодовых мушек. Сегодня мы покажем вам процедуру вскрытия живых эмбрионов опала.

Мы использовали эти методы для поиска лигандов орфанных рецепторов. Мы делаем это путем скрининга коллекций линий по экспрессирующим белкам клеточной поверхности путем окрашивания эмбрионов живыми белками слияния рецепторов. Мы также используем эту процедуру в лаборатории для изучения эмбриональных фенотипов и проведения генетического скрининга.

Я провел скрининг дефицита двигательных актов на направляющие фенотипы. Итак, приступим. Питер покажет вам, как это делается.

Для начала с помощью шпателя нанесите пятно дрожжевой пасты на тарелку для сбора виноградных яиц, соответствующую каждой из бочек камеры для сбора эмбрионов. Затем введите углекислый газ в флаконы с мухами, чтобы усыпить мух. Перенесите несколько сотен мух прямо в камеру сбора.

Затем накройте камеру пластиной для сбора яиц и прижмите Используя полосу маркировочной ленты длиной 20 дюймов, обмотайте камеру и пластину вместе, начиная с середины агаровой пластины. Лента будет накладываться внахлест на тарелку для сбора яиц. После того как мухи проснутся, инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение двух-трех часов в горизонтальном положении после инкубации, постучите мух вниз и установите на место сборную пластину.

Если на каждом секторе удаленной пластины присутствует менее 100 эмбрионов. Продолжайте выполнять двухчасовой сбор до тех пор, пока не будет собрано достаточное количество эмбрионов. Собранные эмбрионы могут быть объединены в соответствии со спецификациями в сопроводительном письменном протоколе.

Чтобы состарить эмбрионы, положите влажный кусок 90-миллиметровой круговой фильтровальной бумаги в крышку чашки Петри и положите на нее тарелку для сбора с эмбрионами вверх ногами. Инкубируйте планшет в течение нужной продолжительности и при нужной температуре, подготовьте предметное стекло для стадирования и сортировки эмбрионов, наложив на предметное стекло двустороннюю липкую ленту. Затем поместите прямоугольную плиту из виноградного агара на S-образное горло.

Яйцо должно быть достаточно большим, чтобы вместить от пяти до 10 рядов по 10-15 эмбрионов. Как только эмбрионы достигнут желаемой стадии, извлеките эмбрионы из инкубатора. Переложите состарившиеся эмбрионы со сборной пластины на двустороннюю липкую ленту.

С помощью влажной кисти равномерно распределите зародыши по ленте. Под микроскопом GFP препарируют эмбрионы SOAR для соответствующей экспрессии GFP, на что указывает генотип. В этом эксперименте генотипирование проводится путем отбора эмбрионов, у которых отсутствует экспрессия балансира кудрявой руки, GFP.

Поскольку генотипирование эмбриона будет варьироваться в зависимости от используемого балансировщика, пожалуйста, обратитесь к прилагаемому письменному протоколу для получения дополнительной информации о его выполнении. Шаг. Далее с помощью тупой иглы для препарирования обмажьте эмбрионы, аккуратно прокатав их по двусторонней липкой ленте. На стадии 16 кишечник разделился на три полосы.

После этого в кишечнике начинают развиваться диагональные полосы возле хвоста, а затем скручиваются, и эмбрион становится более чистым. Затем с помощью иглы для пресечения перекатайте каждый эмбрион поверх кориона или других эмбрионов. Избегая контакта с лентой, поднимите зародыш и перенесите его на плиту виноградного агара.

Выровняйте покрытые оболочкой эмбрионы на этой плите их спинными сторонами против агаровой плиты и задними концами вниз. Затем поместите предметное стекло в чашку Петри с влажной фильтровальной бумагой и инкубируйте эмбрионы при комнатной температуре, пока они не достигнут желаемого возраста Для вскрытия подготовьте предметное стекло для живого вскрытия, вырезав небольшой прямоугольный кусок двусторонней липкой ленты. Поместите ленту рядом с одним концом супер инея плюс горку с помощью восковой ручки.

Нарисуйте вокруг ленты прямоугольник шириной со слайд и длиной от 30 до 40 миллиметров. Между воском и лентой должно быть примерно три миллиметра пространства. Затем перенесите эмбрионы с большой плиты пластины на ленту, перевернув предметное стекло и осторожно опустив его на выстроенные эмбрионы так, чтобы лента соприкасалась с ними.

Эмбрионы должны быть ориентированы задними концами вниз. После переноса эмбрионы будут расположены дорсальной стороной вверх на предметном стекле, сразу же добавьте один XPBS поверх эмбрионов, чтобы заполнить восковой прямоугольник с помощью стеклянной иглы для препарирования, которая сделана на иглесъемнике, как игла для инъекций. Разрежьте по средней линии спины, начиная с заднего конца эмбриона.

Теперь проткните передний конец эмбриона и поднимите его вверх. Начиная снизу, перенесите эмбрион вправо от полоски ленты, удерживая его в буфере. Продолжайте препарировать и пересаживать эмбрионы, выстраивая на предметном стекле упорядоченный ряд эмбрионов, который соответствует каждому ряду на сельскохозяйственной плите.

С помощью рассекающей иглы аккуратно надавите на створки стенки тела на предметное стекло. Не допуская растяжения или удаления материала с их поверхности. Игла должна касаться только переднего и заднего углов на дорсальных краях стенки тела.

Так как моторные аксоны не простираются так далеко. Дорсально избегайте прикосновения к иглам предметного стекла, так как оно сломается после того, как все эмбрионы будут перенесены и прикреплены к предметному стеклу. Удалите кишечник у каждого эмбриона, отрезав четыре кишки от области мозга и оттянув весь кишечник от эмбриона.

Выместите заднюю кишку на горку. После того, как все рассечения будут завершены, используйте две прошлые пипетки, чтобы одновременно доставить комнатную температуру, 5% формальдегида в один угол воска, прямоугольник и удалить раствор из противоположного угла. Замените фиксирующий раствор три раза, используя общий объем около шести миллилитров.

Инкубируйте эмбрионы в фиксирующем растворе в течение 45 минут. Очень важно не допускать контакта мениска с эмбрионами, так как это приведет к их уничтожению. С помощью дозатора удалите большую часть фиксирующего раствора.

Промойте PB S3 раз методом двух пастбищных пипеток. Затем промыть ПБТ три раза, чтобы пропитать зародыши. Этот шаг также делает эмбрионы менее чувствительными к мениску.

После окончательной промывки осторожно удалите ПБТ, наклонив предметное стекло, и кратко прикоснитесь салфеткой Kim к углу области, закрытой воском, чтобы удалить излишки раствора. С помощью предварительно загруженной пипетки человек немедленно добавляет 200 микролитров блокирующего раствора в течение 10-30 минут. При комнатной температуре удалите блокирующий раствор с помощью салфетки Кима.

Затем сразу же добавляют 200 микролитров нужного первичного антитела, разведенного в блокирующем растворе. Поместите предметное стекло во влажную тарелку и выдерживайте в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. В этом эксперименте моноклональное антитело 1D four используется для мечения моторных аксонов.

На следующий день снимите посуду с четырех градусов Цельсия и трижды вымойте эмбрионы на качающейся платформе с PBT не менее 15 минут за одну стирку. На всех этапах мойки убедитесь, что имеется достаточное количество PBT для полного погружения горки во время качания. После того, как эмбрионы будут промыты, заблокируйте предметное стекло, как и раньше.

После блокировки немедленно добавьте 200 микролитров вторичного антитела и блокирующий раствор и инкубируйте два часа при комнатной температуре, здесь Alexa 4 88 go anti-US. Вторичный используется в сочетании с Rodine Phin для маркировки мышечных волокон. Снова трижды постирайте с PBT на качающейся платформе не менее 15 минут за одну стирку.

Переложите предметные стекла в другой лоток, чтобы удалить остатки моющего средства. Затем два раза промыть PBS в течение пяти минут. Снимите с предметного стекла с графика PBS большую часть оставшихся PBS из лунки с помощью химической салфетки и немедленно добавьте 500 микролитров 70% глицерина.

Поскольку глицерин имеет тот же показатель преломления, что и эмбрион, выполнение этого шага сделает окрашивание более заметным, очистите эмбрионы на два часа при комнатной температуре или на ночь при четырех градусах Цельсия. Затем удалите глицерин салфеткой ким. Удаление почти всего глицерина сделает эмбрионы плоскими, в то время как удаление меньшего количества глицерина приведет к более трехмерной структуре.

После того, как глицерин будет удален, наденьте защитный лист номер один. Эмбрионы готовы к визуализации, препарированные и окрашенные эмбрионы могут быть визуализированы с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Здесь препарированный эмбрион был окрашен антителом для мечения моторных аксонов 1D 4.

Это изображение похоже по внешнему виду на более часто встречающиеся изображения, на которых иммуногистохимия HRP использовалась для визуализации с помощью иммунофлуоресценции. Можно получить изображения более высокого качества, на которых более четко видны детали ветвей аксонов мотора. Потому что окрашивание ро домином меченным фином, который связывает актин, позволяет одновременно визуализировать мышцы.

Это дает более четкую картину расслоения и организации мышц, чем может быть получено с помощью окрашивания HRP Здесь 1D, четыре или моторных аксона показаны зеленым цветом Фейна, или мышцы показаны красным. Мы только что продемонстрировали, как препарировать живые эмбрионы дрозофилы из коллекций мутантных линий. Когда вы выполняете эти процедуры, важно начать с простых линий, таких как lio, armadillo, GFP, сбалансированные акции, и просто выполнять несколько линий за раз.

По мере того, как вы становитесь более опытными и быстрыми с вскрытием, вы можете делать до 10 линий в день, и это позволит вам отсеять коллекцию из 200 или около того мутантных линий за период 20 дней или около того. Так что это действительно очень эффективная процедура, как только вы станете экспертом в выполнении всех шагов. Вот и все, и спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.