Безлинзовой на кристалле изображений клеток обеспечивает новый инструмент для высокой пропускной Cell-биологии и медицинской диагностики

В этом видео представлена проверка концепции системы для визуализации на чипе с использованием списка линз, получившей название Lucas. Lucas расшифровывается как платформа массива для мониторинга клеток с ультрашироким полем зрения на основе списка линз и теневой визуализации. В отличие от традиционных установок для визуализации, платформа Lucas не требует использования микрообъективов или других громоздких оптических компонентов.

В случае Лукаса исследуемый образец помещается на предметное стекло микроскопа и осторожно накрывается идентичным покровным стеклом. С помощью вакуумного пера образец переносится на активную область оптоэлектронной сенсорной матрицы. Затем платформа визуализации регистрирует теневые изображения или цифровые голограммы линз каждой интересующей клетки в пределах поля зрения.

Автоматизированная цифровая обработка теней этих клеток позволяет определить тип, количество и относительное положение клеток в растворе. Поле зрения может достигать 18 см² при глубине резкости около пяти миллиметров. Полученные дифракционные изображения затем обрабатываются с помощью специально разработанного алгоритма принятия решений для характеристики и идентификации целевых клеток или частиц.

Система Lucas представляет собой миниатюризированную платформу, которая снижает затраты и значительно увеличивает пропускную способность экспериментов на основе визуализации, обеспечивая совместимость с передовыми современными технологиями в области микрофлюики и биологических исследований. Здравствуйте, я представляю лабораторию био- и нанотехнологий (ROM Bio and Nano Laboratory) кафедры электротехники Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе, а я — Энтони Эрлингер, также из лаборатории нано- и биофотоники. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру высокопроизводительного анализа и визуализации гетерогенного раствора с содержанием SA, например, образца цельной крови.

В данной процедуре в нашей лаборатории используется новый метод визуализации, который мы называем платформой мониторинга клеточных массивов со сверхшироким полем зрения на основе системы линз и теневого имиджинга, или сокращенно Lucas. Итак, приступим. Для начала процесса возьмите 3 mL цельной крови и полистирольные микросферы различных диаметров, например 5, 10 и 20 µm, и выдержите их при комнатной температуре в течение 30 минут.

С помощью серологической пипетки добавьте 2 мл классической жидкой среды RPMI 1640 в качестве разбавителя в стерильную полипропиленовую пробирку объемом 5 мл. После 30-минутного периода седиментации отберите 10 µL образца эритроцитов со дна пробирки с цельной кровью и перенесите его в раствор RPMI. Добавьте полистирольные микросферы общим объемом 20 µL в разбавление эритроцитов в RPMI и перемешайте клеточную суспензию путем осторожного пипетирования. С помощью пинцета перенесите от 5 до 15 µL полученной гетерогенной смеси на покровное стекло.

Поместите второе такое же покровное стекло поверх раствора. Образец должен быть равномерно зажат между двумя покровными стеклами. Затем с помощью вакуумного захвата поместите образец на активную область сенсорной матрицы для получения изображений.

Затем приготовьте водный окрашивающий реагент, смешав 0,1% буферизированный раствор SNY и разбавленный раствор нового метиленового синего (NMB) в объемном соотношении 2:1; подробности приготовления растворов SNY и нового метиленового синего см. в прилагаемом письменном протоколе. Затем в полипропиленовом стакане смешайте окрашивающий реагент ACOA с образцом цельной крови в объемном соотношении 1:1, перемешивая с помощью магнитного перемешивателя в течение двух минут. После этого инкубируйте смесь еще 10 минут при комнатной температуре, затем перенесите 1,99 мл полученного раствора в полипропильную пробирку объемом 5 мл с жидким классическим раствором RPMI 1640.

Затем перенесите 10 µL окрашенного раствора крови в среду RPMI, чтобы получить соотношение объемов 1:200. После этого перемешайте раствор на вортексе в течение 30 секунд, затем с помощью пипетки нанесите от 10 до 100 µL раствора окрашенных клеток между покровными стеклами или в резервуар микрофлюидного устройства. Затем, используя вакуумный захват, поместите образец на активную область сенсорной матрицы.

Платформа Lucas использует массив оптоэлектронных датчиков для цифровой записи голограмм безлинзовых клеток. С этой целью применяются приборы с зарядопереносом (ПЗС), чтобы обеспечить освещение с регулируемой длиной волны; для этого может использоваться монохроматор с ксеноновой лампой в сочетании со стандартным кварцевым волокном, которое представляет собой пучок волокон и диафрагму с отверстием диаметром около 100 мкм, расположенную примерно в 5–10 см над поверхностью датчика. Освещение с регулируемой длиной волны обеспечивает гибкую платформу, позволяющую точно настраивать голографические признаки клеток и синтезировать гибридные цифровые признаки путем объединения нескольких длин волн для улучшения соотношения сигнал/шум и контрастности изображения Lucas.

Для более точной характеристики образцы, помещенные между двумя покровными стеклами, загружаются в активную область сенсорной матрицы, которая равномерно освещается источником света. Дифракционные голограммы каждой клетки или микрообъекта в гетерогенном растворе попадают на сенсорную матрицу, формируя изображение Лукаса. Полученные дифракционные изображения Лукаса обрабатываются специально разработанным алгоритмом принятия решений, который использует статистическую библиотеку дифракционных изображений для автоматической характеристики и идентификации целевых клеток или микрообъектов.

На этом рисунке представлено стандартное изображение при использовании объектива 40x гетерогенного раствора, содержащего полистирольные микросферы размером 5, 10 и 20 микрометров, а также эритроциты. 3D-морфология, показатель преломления и взаимная сложность этих частиц различаются между собой.

Некоторые из этих особенностей можно различить под обычным микроскопом, однако область обзора на платформе Lucas крайне ограничена и составляет менее 0,5 квадратных миллиметров. Все эти микрочастицы демонстрируют уникальные голографические паттерны, подобные отпечаткам пальцев. Следовательно, их можно однозначно идентифицировать на основе их 2D-текстур.

Lucas позволяет контролировать сверхширокое поле зрения, размер которого может достигать 10–20 квадратных сантиметров. Это на несколько порядков больше, чем у стандартных микроскопов с линзами. На данном изображении представлен окрашенный образец цельной крови, полученный с использованием объектива 40x на платформе Lucas.

Внутренние особенности окрашенных лейкоцитов эффективно варьируются за счет изменения показателя преломления и рассеивающих свойств ядер клеток. Сенсорная матрица регистрирует характерные дифракционные картины каждой отдельной клетки. Это демонстрирует еще одно преимущество платформы Lucas как мощного инструмента для экспресс-цитометрии и диагностических целей.

Поскольку данная платформа является полностью автоматизированной системой для быстрой характеристики интересующих клеток, изображения дифракции Лукаса обрабатываются в цифровом виде с помощью специально разработанного программного обеспечения для принятия решений. На этом рисунке интерфейс обрабатывает гетерогенную смесь эритроцитов и микросфер. Алгоритм эффективно обнаруживает как области с высокой плотностью, так и частицы с низким отношением сигнал/шум, такие как микросферы размером 3 мкм.

Здесь представлено обработанное изображение в пользовательском интерфейсе Lucas. Программное обеспечение позволяет вводить различные параметры, такие как размер пикселя датчика или длина волны освещения. Кроме того, можно выделять области изображения и определять паттерны клеток.

Подсчет образца осуществляется на основе этих данных, и пользователю отображается размеченное изображение. Мы только что продемонстрировали вам способ получения изображений и характеристики клеток с использованием высокопроизводительной платформы Lucas. При выполнении данной процедуры важно помнить, что продемонстрированные эксперименты могут быть применены к широкому спектру типов клеток и микрочастиц.

Это также позволяет проводить характеристику клеток в гетерогенном растворе в сверхшироком поле с высокой пропускной способностью. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.