Автоматизированная микрожидкостных протокол Лизис кровь для обогащения Циркуляционные ядерных клеток
31 декабря 2009 г.
Автоматизированные микрожидкостных Прибор был разработан для циркуляции зарождаются обогащения клетка из периферической крови через лизис эритроцитов, что обеспечивает изоляцию высокого качества образцов без потерю клеток.
Для обогащения пробы крови циркулирующими нуклеированными клетками. Сначала микрофлюидное устройство подготавливают, прокачивая через него один объем XPBS для удаления пузырьков воздуха; затем, перед загрузкой образца крови, с помощью шприцевых насосов через устройство пропускают деионизированную воду и 2% паральдегид в двух объемах XPBS. После этого кровь пропускают через микрофлюидное устройство и собирают; последующая обработка образца включает центрифугирование и удаление супернатанта.
Наконец, образец анализируют с помощью проточной цитометрии для построения факс-графиков. Здравствуйте, я Уильям Уайт из лаборатории микромасштабных биотехнологий кафедры биоинженерии Университета Вул. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру обогащения циркулирующих нуклеированных клеток путем лизиса цельной крови с помощью микрофлюидики.
Мы используем данную процедуру в нашей лаборатории для изучения воспаления при различных патологических процессах, чтобы обеспечить обогащение лейкоцитами и другими циркулирующими нуклеированными клетками без их потери или активации. Итак, приступим. Для начала процедуры вставьте соединительные трубки, диаметр которых немного больше диаметра отверстий доступа в канале на входе и выходе.
Затем для создания интерфейса между макро- и микромасштабом прикрепите иглу шприца 30G к трубке каждого из входов. Далее наполните шприц объемом 1 мл раствором 1X PBS, убедившись в отсутствии пузырьков воздуха. Подсоедините шприц к первому входу и осторожно нажмите на поршень вручную до тех пор, пока раствор 1X PBS не начнет вытекать из второго входа.
Затем немедленно зажмите второй входной канал офисным зажимом для бумаг. Продолжайте нажимать на шприц до тех пор, пока раствор 1X PBS не достигнет выходного порта микрофлюидного устройства. Как только раствор начнет вытекать из выходного порта, зажмите выходную трубку другим зажимом.
Продолжайте медленно нажимать на шприц объемом 1 мл до тех пор, пока XPBS не начнет вытекать из входа 3, после чего зажмите порт входа 3 третьим канцелярским зажимом. Теперь микрофлюидное устройство полностью заполнено. Начните калибровку шприцевых насосов с помощью большого насоса Harvard, установив значение диаметра 22,5 мм и скорость потока 600 мкл/мин.
Для малого шприцевого насоса Harvard установите значение диаметра 4.61 millimeters, а скорость потока — 20 microliters per minute. Затем наполните один шприц объемом 30 milliliter деионизированной водой, набирая раствор непосредственно из конической пробирки объемом 50 milliliter.
Не забудьте промаркировать шприц, затем наполните другой шприц объемом 30 мл раствором 2% параформальдегида в 2 XPBS. Снова наберите раствор непосредственно из конической пробирки и промаркируйте шприц. Теперь подсоедините шприц с водой к входу два, а шприц с 2% параформальдегидом в 2 XPBS — к входу три, убедившись в отсутствии пузырьков воздуха в трубках или в микрофлюидном устройстве.
Затем снимите зажимы с входной трубки два, входной трубки три и выходной трубки при подключенных всех трех шприцах. Поместите два больших шприца в большой шприцевой насос Harvard, а шприц объемом 1 мл — в малый шприцевой насос Harvard. Поместите выходную трубку в коническую пробирку для сбора отходов объемом 50 мл.
Теперь включите большой шприцевой насос Harvard, в котором установлены шприцы объемом 30 мл, и дайте ему поработать в течение одной минуты. Убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха и утечек в устройстве или трубках. Затем включите малый шприцевой насос Harvard и также дайте ему поработать еще одну минуту.
Проверка на наличие пузырьков воздуха и утечек. Остановите насосы через две минуты. Поскольку микрофлюидное устройство теперь готово к работе с образцами крови, образцы крови для анализа собирают согласно прилагаемому письменному протоколу и используют в течение одного часа после сбора.
Первая пробирка собранной крови утилизируется во избежание ложноположительных результатов. Снимите шприц объемом 1 мл с миниатюрного шприцевого насоса Harvard, затем введите 1 XPBS из шприца объемом 1 мл, заполняя иглу шприца. Чтобы избежать попадания пузырьков воздуха, наполните шприц объемом 1 мл 50 µL 1 XPBS, следя за тем, чтобы внутри не осталось пузырьков.
Затем наполните шприц 0.5 мл крови. Во время наполнения держите шприц вертикально, чтобы избежать смешивания PBS с кровью. Далее подсоедините шприц с кровью обратно к входу один.
Удалите излишки жидкости и установите шприц вертикально в малый шприцевой насос Harvard. Будьте осторожны, чтобы не вытолкнуть кровь через трубку в устройство. Извлеките выходную трубку из трубки для отходов и поместите ее в чистую центрифужную пробирку объемом 50 milliliter, находящуюся в контейнере со льдом.
Теперь начните выполнение: сначала включите большой шприцевой насос Harvard и дайте ему поработать в течение одной минуты. Затем включите малый шприцевой насос Harvard. Образец начнет поступать из выходного трубки в центрифужную пробирку объемом 50 milliliter.
Позвольте образцу крови в одномиллилитровом шприце полностью пройти через устройство; этот процесс занимает приблизительно 20 минут. Затем остановите оба насоса. После завершения цикла центрифугируйте собранный образец в течение пяти минут при 350 ×g при комнатной температуре с отключенным торможением.
Удалите супернатант, поместив наконечник пипетки с противоположной стороны от белого осадка. Удалите максимально возможный объем супернатанта, особенно фрагменты эритроцитов, не затрагивая белый осадок. Ресуспендируйте образец в одном миллилитре потокового буфера, содержащего 1%BSA и 2%параформальдегида в 1XPBS, путем пипетирования.
Перенесите образец в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте собранный образец в течение пяти минут при 4×g. При комнатной температуре осторожно удалите супернатант, как и на предыдущем этапе центрифугирования. В конце добавьте 1 мл буфера для проточной цитометрии, перемешайте на вортексе для ресуспендирования образца и приступите к анализу образца методом проточной цитометрии.
Теперь мы представим репрезентативные результаты в виде факс-диаграмм образца крови, обогащенного с помощью микрофлюидного устройства, с последующим анализом методом проточной цитометрии. Важность обогащения путем лизиса видна на факс-диаграмме, где наблюдается облако эритроцитов. Диаграмма рассеяния, полученная с помощью протокола микрофлюидного обогащения, представляет собой чистую диаграмму с четко определенными популяциями нуклеированных клеток, циркулирующих в крови.
Красная область соответствует лимфоцитам, зеленая — моноцитам, синяя — гранулоцитам, а пурпурная область еще не охарактеризована. Если в протоколе не удалить остатки эритроцитов, на графике FACS в голубой области появится скопление событий. Популяции клеток можно визуализировать на отдельных графиках FACS.
Лимфоциты идентифицировали по CD3 и CD4, моноциты — по CD14, а гранулоциты — по CD66p. Мы только что продемонстрировали, как подготовить и пропустить образец крови через микрофлюидное устройство для лизиса крови. При выполнении данной процедуры важно помнить, что образец крови следует пропускать немедленно, чтобы PBS не смешался с кровью до поступления в устройство и чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в каналы устройства.
На этом всё. Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Было разработано автоматизированное микрофлюидное устройство для обогащения циркулирующих нуклеированных клеток из периферической крови посредством лизиса эритроцитов. Данный метод обеспечивает выделение высококачественных образцов без потери клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микрофлюидика
- Обогащение клеток
- Обработка образцов крови
Теоретические основы
- Циркулирующие нуклеированные клетки имеют важное значение для различных биомедицинских приложений.
- Традиционные методы обогащения клеток могут привести к потере и деградации образцов.
- Микрофлюидные технологии обеспечивают точный контроль над гидродинамикой.
- В данном исследовании представлено новое устройство для эффективной изоляции клеток.
Цель исследования
- Разработка микрофлюидного устройства для обогащения циркулирующими нуклеированными клетками.
- Минимизация потери клеток в процессе обработки образца.
- Повышение качества изолированных образцов для последующего использования в анализах.
Используемые методы
- Микрофлюидное устройство заполняют XPBS для удаления пузырьков воздуха.
- В устройство вводят деионизированную воду и 2% паральдегид.
- Образцы крови пропускают через устройство с помощью шприцевых насосов.
- Пост-обработка включает центрифугирование и удаление супернатанта.
Основные результаты
- Устройство успешно обеспечило обогащение образцов крови циркулирующими нуклеированными клетками.
- Были получены высококачественные образцы с минимальной потерей клеток.
- Проточная цитометрия позволила провести детальную характеристику изолированных клеток.
- Метод продемонстрировал воспроизводимость и эффективность обогащения клеток.
Выводы
- Автоматизированное микрофлюидное устройство эффективно для выделения циркулирующих нуклеированных клеток.
- Данный подход может быть применен в различных исследовательских и клинических условиях.
- Будущая работа может быть сосредоточена на оптимизации устройства для различных типов образцов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Автоматизированный микрофлюидный лизис крови обеспечивает воспроизводимое обогащение циркулирующих нуклеированных клеток (ЦНК) из цельной крови, снижая вариабельность, связанную с человеческим фактором, и потерю образцов. Это способствует надежному иммунному мониторингу и изучению патогенеза заболеваний, обеспечивая получение чистых образцов, готовых для проточной цитометрии. Данный протокол повышает достоверность прогнозов в рабочих процессах валидации мишеней за счет стандартизации изоляции ЦНК для последующего функционального анализа.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать фенотипы лейкоцитов и эндотелиальных клеток для выяснения иммунных механизмов в моделях заболеваний.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированное обогащение CNC без селективных потерь, что повышает воспроизводимость между экспериментальными повторами.
- Прогностическая ценность: способствует поиску биомаркеров за счет сохранения нативных состояний клеток для проточной цитометрии и функциональных анализов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать однородные популяции CNC для разработки анализа, сводя к минимуму влияние мешающих факторов, вызванных остатками эритроцитов.
- Практическая ценность: Автоматизирует этапы лизиса и промывки, сокращая время непосредственной работы и техническую вариабельность при подготовке образцов.
- Готовность к анализу: На выходе получаются фиксированные ресуспендированные CNC, совместимые с проточной цитометрией и панелями мультиплексного окрашивания.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Связывает динамику периферических иммунных клеток с механизмами заболевания посредством количественного анализа CNC.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность лонгитюдного отбора проб с минимальным количеством артефактов обработки, поддерживая преемственность между доклиническими и клиническими исследованиями.
- Снижение рисков: Снижает вероятность появления ложных сигналов от остаточных эритроцитов, повышая достоверность данных в фармакодинамических исследованиях.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в рабочие процессы от ранних этапов поиска до доклинических исследований, обеспечивая стандартизированный входной материал для иммунного профилирования и функциональной валидации.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез путем выделения жизнеспособных CNC для анализа сигнальных путей и исследований взаимодействия с мишенями.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимый входной клеточный материал для скринингового анализа, повышая достоверность перехода от поиска хитов к оптимизации соединений-лидеров.
- Аналитика: обеспечивает количественное разрешение диаграмм рассеяния для многопараметрической проточной цитометрии, облегчая гейтирование популяций и количественную оценку субпопуляций.
- Трансляционные исследования: связывает иммунный мониторинг по крови с доклиническими моделями заболеваний за счет стабильного восстановления CNC.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для иммунного мониторинга в различных терапевтических областях и при различных показаниях заболеваний.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает уверенность в валидации мишени за счет снижения механистической неопределенности, вызванной артефактами подготовки образцов.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию и масштабируемость обработки крови в различных лабораториях и центрах.
- Стратегическая ценность: Поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет получения надежных данных об иммунных биомаркерах на ранних этапах поиска.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе воспроизводимых функциональных показателей, полученных с помощью CNC.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с микрофлюидными устройствами, калибровки шприцевых насосов и настройки проточной цитометрии.
- Необходимо наличие шприцевых насосов, микрофлюидных чипов, центрифуг и проточных цитометров.
- Требуется стандартное обучение для предотвращения попадания пузырьков воздуха и обеспечения стабильного заполнения системы и загрузки образцов.
- При использовании альтернативных антикоагулянтов или других объемов образцов может потребоваться корректировка скорости потока и размеров каналов.
- Практические ограничения включают риск засорения устройства при работе с образцами с высоким гематокритом, а также необходимость немедленной обработки образцов для предотвращения изменений ex vivo.
