ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Поддержке развития карьеры награду от исследований в области профилактики слепоты, NIH грант Е.Ю. 019312, и неограниченный грант исследований в области профилактики слепоты и EY 02 687 (кафедра офтальмологии и Визуальный наук в Университете Вашингтона).

Создание электродов <ol><li> Сделать запись электродов использованием съемника микропипетки и польский электродов с отоплением нити под микроскопом. Для мыши конус одноклеточных всасывания записи, внутренний диаметр на конце электрода составляет около 6-7 мкм. </li><li> Подготовка электродов сравнения. Взвесьте 1% агара в дистиллированной воде. Растопить агар решение в ванну с горячей водой. Заполните стеклянные пипетки (L = 100 мм, OD / ID = 1/0.75 мм) с 1% агара использованием шприца. Укрепить агар при комнатной температуре в течение 10 минут. </li><li> Разрежьте пополам пипетки помощью алмазной ножом. </li><li> Замочите электродов в раствор сравнения, по крайней мере 24 часов при температуре 4 ° С. </li></ol> Настройка эксперимента <ol start="5"><li> Темные адаптировать мышь в черном клетку на ночь. </li><li> Подготовка 100 мл раствора ведения и 1 л перфузии раствором (см. ниже) и фильтр решение. </li><li> Растворяют 0,1% BSA и 10 мМ глюкозы в 20 мл раствор ссылки. </li><li> Калибровка интенсивности света в оптических стимулятор использованием фотометра. </li><li> Горы записи камеры на сцене инвертированного микроскопа. </li><li> Bubble перфузии раствора с 95% O 2 / 5% CO 2, инкубировать ее в 40 ° С водяной бане для увеличения растворимости СО 2. Решение вытекает из бутылки записи камеры, проходящей через керамический резистор нагревая это до 36-38 ° С. Нагреватель должен быть расположен как можно ближе к записи камеры позиции, желательно на стадии микроскоп. </li><li> Настройте регулятор расхода для потока скоростью около 1-1,5 мл / мин. </li><li> Заполните записи электрода со ссылкой решение. Вставьте электрод в держатель электрода. Убедитесь Есть нет пузырьков в электроде. Горы держатель на headstage усилителя. Подключите держатель для всасывающего устройства, который построен путем соединения трубки, частично заполненной минеральным маслом в сторону порта из держателя электрода. Другой конец трубки соединен с небольшим резервуаром нефтепродуктов, к которым давление может быть применен в рот. </li><li> Подключение электрода к другому полюсу headstage. Привязка тепловые пара (ТС) для электрода сравнения. Убедитесь, что электрод и ТК советы близко друг к другу так, чтобы температура чтении принимается близко к клетке как это возможно. </li><li> Включите ИК-подсветки для визуализации электрода. Электрод рассматривается инфракрасная камера подключена к монитору. Центр электрода изображение на поля зрения и монитора с помощью микро-манипулятором. </li><li> Отрегулируйте положение кончика электрода близко (2-4 мм), чтобы кончик электрода записи. </li><li> Отрегулируйте напряжение постоянного тока на нагреватель так, чтобы температура раствора составляет около 36-38 ° C. </li><li> Выполнить печать, чтобы проверить сопротивление электрода записи, как правило, около 900 кОм. </li></ol> Изоляция мыши сетчатки <ol start="18"><li> Под тусклый красный свет, эвтаназии темно-адаптированной мышь с CO 2 и цервикальной дислокации. Марк глазные яблоки с помощью иглы горячей факел металла прижигание наиболее спинной точки склеры чуть-чуть. Выявлять глазные яблоки с помощью ножниц. Все последующие процедуры проводятся под инфракрасным излучением. </li><li> Hemisect глазных яблок под микроскопом с ИК подсветкой и преобразователей. </li><li> Удалить роговицы и хрусталика. Удалить столько стекловидного насколько это возможно. </li><li> Для записи M-конус ответов, удалить вентральной части наглазник 4 с лезвием судя по прижигания марки. </li><li> Пил сетчатку от слоя пигментного эпителия. </li><li> Свести сетчатки и положите его на дно чашки Петри, заполненные 1-2 решение ссылкой мл. </li><li> Нарежьте сетчатки на мелкие тонкие части, используя лезвие бритвы и инкубировать подготовку в светонепроницаемый ящик насыщенной чистым кислородом. </li></ol> Записи <ol start="25"><li> Выключите обогреватель временно. Коммутатор перфузии поток обойти трубы, чтобы предотвратить камеры от высыхания. </li><li> Слейте большую часть раствора в камере используя часть Kimwipe ткани. Передача сетчатки подвески записи камеры с помощью стеклянной пипетки. </li><li> Подождите около 2 минут, пока сетчатка ломтиками успокоиться. Коммутатор перфузии обратно. Включите нагреватель. </li><li> Включите инфракрасную подсветку для визуализации подготовки. Поиск часть сетчатки лежал на камеру с наружных сегментов фоторецепторов торчащие (см. пример рисунок). Нарисуйте внутренние сегменты мягко в электроде всасывания. В этой конфигурации, несколько ядер и внутренний сегменты должны быть вовлечены в электроде. Запись фотоотклика на яркую вспышку для проверки конуса внутренний сегмент находится в электроде и является ли ячейка исцелитьтвой, судя по реакции кинетики и амплитуды. </li><li> Нижняя минеральных водохранилище применить небольшое отрицательное давление до кончика электрода, чтобы помочь провести внутренний сегмент в электроде. </li><li> Запись тест-вспышкой ответы от тусклом до ярко интенсивности раз хороший ячейка найдена. Испытание вспышки осуществляется от калиброванного оптического стимулятор 5. Интенсивность вспышки и длины волны контролируются набором фильтры нейтральной плотности и узкие фильтры интерференционной полосы, соответственно. Испытание длительность вспышки (20 мс) управляется компьютером управляемых жалюзи. </li></ol> Решения <ol><li> Мышь перфузии решение: 112,5 мМ NaCl, 3,6 мМ KCl, 2,4 мМ MgCl 2, 1,2 мМ CaCl 2, 10 мМ HEPES (рН 7,4), 20 мМ NaHCO 3, 3 мМ Na сукцинат, 0,5 мМ Na глутамата, 0,02 мМ ЭДТА и 10 мМ глюкозы. </li><li> Мышь записи электрода решение: 140 мМ NaCl, 3,6 мМ KCl, 2,4 мМ MgCl 2, 1,2 мМ CaCl 2, 3 мМ HEPES (рН 7,4), 0,02 мМ ЭДТА. </li></ol>

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors+of+Nrl+-%2F-+mice+coexpress+functional+S-+and+M-cone+opsins+having+distinct+inactivation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms.</a> J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+that+underlie+bleaching+and+background+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation.</a> J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
</ol>

Одноклеточный всасывания записи с фоторецепторных клеток был разработан три десятилетия назад. Это дает нам возможность записи трансмембранный ток изменение, вызванное световой стимуляции, не проникая клеточной мембраны. Из-за высокой межклеточной адгезии, трудно выделить одну здоровую палочек и колбочек сетчатки от мыши, как амфибии сетчатки, и трудно найти индивидуальный конусы из-за низкого процента (3%) и небольшого размера. Внутренний сегмент в (IS-в) способ записи позволяет преодолеть эту трудность, тока записи от...

Одноклеточный Всасывающая recordings от фоторецепторов Мышь Конус

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Палочек и колбочек фоторецепторов в сетчатке отвечают за свет обнаружения. В темноте, циклических нуклеотидов закрытого (СПГ) каналы во внешнем сегменте являются открытыми и позволяют катионов течь постоянно внутрь через мембрану, деполяризующего клетки. Освещенность вызывает закрытие каналов СПГ, блоки внутрь катионного тока, и таким образом приводит к ячейке гиперполяризации. На основе полярности фоторецепторов, методом всасывания запись была разработана в 1970-х годов, что, в отличие от классического патч-зажим технику, не требует проникновения в мембране<sup&gt; 1</sup&gt;. Рисование внешней сегмента в плотно облегающие стеклянной пипетки заполнены внеклеточной решение позволяет записывать текущие изменения в отдельных клетках на тест-вспышкой. Однако, это устоявшийся »наружного сегмента в (OS-в)&quot; всасывания записи не подходит для записи мыши конуса, из-за низкого процента конусов в сетчатке мышей (3%) и трудности в определении конуса наружные сегменты. В последнее время внутреннего сегмента в (IS-в) запись конфигурации был разработан, чтобы сделать внутренний сегмент / ядерной области фоторецепторов в записи пипетки<sup&gt; 2,3</sup&gt;. В этом видеоролике мы покажем, как для записи с отдельными мыши конус photoresponses использованием одноклеточных всасывания электрода.

Мы покажем, как для записи вспышка ответов от одного конуса мыши, используя всасывания электрода.

Одноклеточный Всасывающая Recordings от фоторецепторов Мышь Конус

Фоторецепторы сетчатки — палочки и колбочки — отвечают за детекцию света. В темноте циклические нуклеотид-зависимые (CNG) каналы во внешнем сегменте...

single-cell-suction-recordings-from-mouse-cone-photoreceptors

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Здесь мы опишем процедуру для получения темно-адаптированных ломтиками мыши сетчатки для электрофизиологических записей.

Патч зажим Recordings от мыши нейронов сетчатки в темно-адаптированной фрагмент подготовка

Мы описываем относительно простой метод transretinal электроретинограммы (ЭРГ) записи для получения палочек и колбочек photoresponses с нетронутой сетчатке мышей. Такой подход имеет преимущество блока синаптической передачи от фоторецепторов, чтобы изолировать их свет ответы и записать их с помощью поля электродов, расположенных по всей изолированные плоские установлен сетчатки.

Transretinal записи ЭРГ от мыши Retina: палочек и колбочек Photoresponses

Источник: Laboissonniere, et. al. РНК-секвенирование одиночных клеток определенных подмножеств ганглиозных клеток сетчатки. J. Vis. exp. (2017).  Это видео демонстрирует метод флуоресцентной трассировки для определения подтипов ганглиозных клеток сетчатки (РГК) в трансгенной сетчатке мыши. Процесс включает в себя закрепление изолированной сетчатки в записывающей камере, поддержание жизнеспособности клеток с помощью оксигенированной перфузии и нацеливание на флуоресцентно меченные РГК с помощью...

Идентификация подтипов ганглиозных клеток сетчатки мыши с помощью флуоресцентной трассировки

Источник: Kulkarni, M. et al. Imaging Ca2+ Динамика в окончаниях аксонов фоторецепторов колбочек сетчатки мыши. J. Vis. Exp. (2015)Это видео демонстрирует использование двухфотонной микроскопии для мониторинга динамики кальция в колбочках фоторецепторов трансгенной сетчатки мыши. В нем описаны этапы подготовки срезов сетчатки, визуализации биосенсоров кальция на основе FRET и анализа изменений флуоресценции для количественной оценки уровня кальция при фоновом освещении и световой стимуляции.

Двухфотонная микроскопия для мониторинга динамики кальция в фоторецепторах колбочек сетчатки мыши

Мы описываем получения тонких срезов сетчатки водных тигра саламандры...

Одновременное Цельноклеточная Записи из фоторецепторов и второго порядков Нейроны сетчатки амфибий Подготовка Slice

Нейронные сетчатки мыши в возрасте 8 дней на вершине 4% желатина блока. После выделения фоторецепторов слоя (200 мкм) по vibratome, фоторецепторы высевают после механической и ферментативной диссоциации культуры. Фоторецептор слой может быть использован для молекулярных, биохимических анализов или трансплантации.

Vibratome секционирования мыши Retina Подготовка фоторецептора культур

Мы продемонстрируем, как приготовить срезы сетчатки из глаза мыши и записать световые реакции в нейронах сетчатки. Вся процедура проводится в условиях, адаптированных к темноте.

Запись Light-вызывала постсинаптические реакции нейронов темно-адаптированных, мышь сетчатки ломтик препаратов с использованием методов локальной фиксации

Мы опишем протокол для мониторинга динамики Ca 2+ в аксонов фоторецепторов колбочек, используя препарат ломтик экс-естественных условиях сетчатки мыши. Этот протокол позволяет комплексные исследования конус Са 2+ сигналов в качестве важного млекопитающих модельной системы, мышь.

Са изображений<sup&gt; 2+</sup&gt; Динамика колбочек аксонов мыши Retina

Мы разработали горизонтальный срез препарата сетчатки у млекопитающих взрослого с плоскостью секционирования параллельно поверхности сетчатки. Дендритные поля нерадиально ориентированных нейронов сетчатки не были усечены, что позволяет изучение обработки сигналов с накладными-смыкания и визуализации методов.

Подготовка горизонтальных слоев взрослых мышей Retina для электрофизиологических исследований

Здесь мы представляем комбинаторный подход для классификации типов нейронных клеток до выделения и для последующей характеристики одноклеточных транскриптомов. Этот протокол оптимизирует подготовку образцов для успешного секвенирования РНК (РНК-Seq) и описывает методологию, разработанную специально для углубленного понимания клеточного разнообразия.

Одноклеточная РНК-Seq определенных подмножеств клеток сетчатки ганглия

Описан способ получения первичных культур колбочка фоторецепторов из сетчатки куриных эмбрионов и его использование для скрининга высокого содержания.

Обогащенные конусом культуры из сетчатки куриных эмбрионов для изучения клеточных взаимодействий между палочками и конусами

Изучите методику одноклеточной всасывающей записи с фоторецепторов мыши. Демонстрация демонстрирует диссекцию сетчатки и регистрацию фотовсплесков конусов с помощью электрода. Этот подход позволяет исследовать электрофизиологические свойства клеток.

Одноклеточный Всасывающая Recordings от фоторецепторов Мышь Конус

Больше видео