Изготовление и эксплуатация Кислород Вставка для Приверженец клеточных культур

Устройство с гипоксической вставкой имеет шесть столбов, которые гнездятся в лунках из шести. Газ из скважинной пластины протекает через микрофлюидную сеть в основании столба и может диффундировать через газопроницаемую мембрану PDMS, разделяя газовую сеть и питательные среды. Это устройство минимизирует длину пути диффузии между источником кислорода, микрофлюидной сетью у основания столба и клетками, что позволяет более быстро концентрировать кислород. Равновесие.

Устройство также обеспечивает гораздо больший контроль над пространственной структурой кислорода, подвергающегося воздействию клеток, которая определяется конструкцией микрофлюидной газовой сети, выполненной с помощью стандартной фотолитографии с использованием фотошаблонов. Здравствуйте, я Шон Ард из лаборатории доктора Дэвида Эдингтона на факультете биоинженерии Университета Иллинойса в Чикаго. Привет, я Элли, тоже из Эдингтонской лаборатории.

Сегодня мы покажем вам, как изготовить, проверить и использовать специальное устройство для воздействия на клеточные культуры in vitro в шестикратной пластине воздействию различных концентраций кислорода. Мы использовали эту процедуру в нашей лаборатории для изучения влияния кислорода на заживление ран, образование активных форм кислорода и их миграцию. Итак, приступим.

Чтобы начать изготовление оксигенирующей вставки, приготовьте полиметилслоун или PDMS в соотношении 10 к одному между предварительным полимером и отвердителем. В соответствии с инструкциями производителя, смесь PDMS добавляется в ранее обработанную форму Dell с рисунком, имитирующим форму стандартной шестилуночной планшета для культивирования. После отверждения при температуре 75 градусов Цельсия в течение ночи полученная копия формованного массива колонн образует первый из трех компонентов, составляющих кислородирующую вставку, чтобы изготовить второй ключевой компонент оксигенирующей вставки.

Мастер SU eight подготавливается путем первого вращения SU 8 21 50. На кремниевую пластину наносится фотошаблон и SU eight подвергается воздействию ультрафиолета через фотошаблон для создания мастер-формы с толщиной микроканала 300 микрометров. Залейте PDMS на верхнюю часть SU eight Master и отверждайте в течение двух часов при температуре 75 градусов Цельсия, чтобы получить положительную форму, которая в конечном итоге сформирует микроканалы в нижней части каждой колонны.

Третий компонент устройства изготавливается путем вращения PDMS на кремниевой пластине со скоростью 500 оборотов в минуту в течение 10 секунд, а затем 900 оборотов в минуту в течение 30 секунд для получения мембранного мозга толщиной 100 микрометров. Поскольку PDM является газопроницаемым, кислород может доставляться в микроканалы непосредственно через эту мембрану. После того, как все компоненты подготовлены, каждая склеиваемая поверхность подвергается кислородной плазменной обработке в течение одной минуты.

С помощью ручного плазменного устройства сначала соедините шесть микроканальных компонентов с массивом столбов, а затем проделайте по два отверстия в каждом столбе, которые будут служить входом и выходом газа. Наконец, приклейте мембрану к нижней части микроканала, чтобы облегчить сцепление и удалить любые пузырьки. Обработанные плазмой поверхности прижимаются друг к другу в течение примерно минуты с помощью смеси с помощью пинцета, выдерживают один час между каждым склеиванием, чтобы убедиться, что устройство полностью склеено и может быть откалибровано.

После того, как готовое устройство изготовлено, необходимо откалибровать уровень кислорода, получаемого клетками при использовании оксигенирующей вставки в реальных экспериментах. Для калибровки используйте флуоресцентный датчик кислорода или кулисное стекло, которое содержит флуоресцентное покрытие из рутения, которое гасится кислородом. Лисьи слайды предварительно нарезаются, чтобы поместиться на дно шестилуночной пластины.

Лисью горку следует обрезать так, чтобы она охватывала как можно большую часть поверхности лунки. Так как кулисное горло имеет толщину около одного миллиметра, модифицируйте устройство так, чтобы оно поддерживало нужное расстояние для адекватной мембраны. Слайдовая диффузия.

Это расстояние зависит от эксперимента, но в большинстве случаев должно быть ниже одного миллиметра с помощью ручного плазменного устройства, скрепленного четырехсрезным стеклом толщиной в один миллиметр. Скользящие стойки примерно шести миллиметров в длину и четыре миллиметра в ширину до нижней части устройства. Устройство будет опираться на стойки в верхней части среза горки.

Стеклянные покровные стекла также могут использоваться для диффузионного зазора в 0,17 миллиметра для проверки использования кислорода. По три миллилитра деионизированной воды комнатной температуры в колодцы из шести лунок будет измеряться кислород. Поместите устройство в тарелку и с помощью программного обеспечения metamorph выберите количество и расположение нужных позиций на фокси-сенсоре.

Сдайте слайд, чтобы определить концентрацию кислорода. Подсоедините трубку тай-пистолета между баллоном с кислородом и устройством гипоксической вставки. Прецизионный регулятор расхода, установленный на расход от 50 до 100 миллилитров в минуту, используется для точного контроля подаваемого газа.

Убедитесь, что прецизионный регулятор расхода закрыт. Сначала откройте регулятор в верхней части бака, а затем регулятор точности. Уменьшите скорость потока до 10-20 в минуту через 15 минут.

Чтобы избежать образования пузырьков в воде, внимательно следите за значением расхода в течение следующего часа и вносите коррективы по мере необходимости, поскольку перепад давления будет меняться, пока система уравновешивает расход, изменяя расход для получения изображений пластины и датчиков Фокси. В работе используется флуоресцентный микроскоп Olympus IX 71, камера устройства зарядовой пары от Q Imaging Tiga, SRV и программное обеспечение для получения изображений Metamorpho. Микроскоп оснащен Olympus 3 1 0 2 0, совместимым флуоресцентным фильтром с длиной волны возбуждения 475 нм и длиной волны излучения 600 нм.

Чтобы проверить время равновесия и степень насыщения кислородом устройства, выберите три точки на предметном стекле, в которых будет измеряться концентрация кислорода. Сделайте снимок предметного стекла непосредственно перед началом потока газа. Делайте снимки с интервалами в 10 секунд в течение 30 минут, когда газ проходит через устройство, чтобы проверить неоднородность и доставку кислорода.

Установите несколько точек с интервалом в один миллиметр по ширине канала и измерьте концентрацию кислорода на поверхности скважины с помощью метаморфа. Экспортируйте среднюю интенсивность изображения для каждого положения и изобразите график концентрации оксигенации в зависимости от интенсивности флуоресценции. Создание калибровочной кривой путем подгонки линейных кривых к линии от нуля до 10% и линии от 10 до 21%, связывающей интенсивность флуоресценции с концентрацией кислорода Для каждой позиции измеренные исходные данные об интенсивности могут быть экспортированы из метаморфа и дополнительно проанализированы с помощью Microsoft Excel или другого статистического программного обеспечения.

После калибровки устройства можно начать такие эксперименты, как анализ заживления ран: откалиброванный вкладыш можно начать в автоклаве при температуре 121 градус Цельсия в течение 15 минут в течение 24 часов до эксперимента и работать с ним в культуральном шкафу с ламинарным потоком для предотвращения последующего загрязнения. Замочите стерилизованную вставку PDMS в среде, не содержащей сыворотки, на 24 часа, чтобы подавить образование пузырьков газа при введении в планшет лунок культуры, клеток MDCK или других адгезивных клеток до 100% плавности в шестилуночном планшете, создать прямые царапины в монослоях с помощью наконечника пипетки P 200. Царапины имитируют раны в адгезивном монослое.

Отсадите клеточную среду, не нарушая монослой, и промойте пятью миллилитрами среды. Снова отсадите и наполните лунки тремя миллилитрами сыворотки бесплатно. Меди аккуратно вставьте прибор в пластину, следя за тем, чтобы не было пузырей.

Наклон устройства во время введения помогает вытолкнуть пузырьки с одной стороны. Будьте осторожны, чтобы не оказывать чрезмерного давления на устройство, которое может деформировать PDMS настолько, что это приведет к раздавливанию нижележащих клеток. Поместите планшет и устройство на предметный столик микроскопа с температурой 37 градусов Цельсия и подсоедините трубку от резервуара для исходного газа к входным и выходным отверстиям устройства.

Инкубатор для культур должен иметь отверстие для входа трубки, и трубка должна быть подсоединена После помещения устройства в инкубатор следуйте той же процедуре запуска потока газа, которая была описана ранее для оценки заживления ран, покадровой съемке клеток каждые 20 минут в течение 15–18 часов с использованием оборудования и программного обеспечения для визуализации, как описано ранее. Алгоритм измерения раны может быть использован для анализа площади незаживающей поверхности после желаемой продолжительности эксперимента. Остановите подачу газа, снимите пластину и при желании приступайте к дальнейшей обработке клетки. Устройству с гипоксической вставкой требуется менее двух минут для стабилизации до 0,5% кислорода, как показано здесь.

Размер зазора между мембранными лунками прибора был критическим фактором в определении эффективности равновесия при больших размерах зазоров, требующих больше времени для достижения значений концентрации кислорода в стационарном состоянии. Устройство также позволяет в значительной степени контролировать пространственное насыщение кислородом в одной скважине, что позволяет формировать несколько условий и даже генерировать циклический профиль кислорода по всей поверхности скважины. Монослои клеток MDCK подвергались воздействию кислорода на 10% или 21%, а площадь поверхности раны анализировалась с течением времени с использованием алгоритма MATLAB Ts.

Через 11 часов из 17 часов 6,87% исходной раны осталось при воздействии 10% кислорода, в то время как 64,4% раны осталось ниже 21%. Как показано здесь, концентрации кислорода отрицательно коррелируют с открытой областью раны для обеих концентраций кислорода. На протяжении всего эксперимента мы только что показали вам, как изготовить, проверить и использовать устройство с гипоксической вставкой для анализа заживления царапин. Устройство имеет ряд преимуществ по сравнению с другими системами оксигенации, таких как меньшая площадь в лаборатории и гораздо больший контроль над пространственной и временной оксигенацией на поверхности клетки.

Устройство может быть использовано практически любой лабораторией, которая изучает влияние кислорода или других газов, таких как углекислый газ, на клеточные культуры in vitro. При проведении этой процедуры важно замочить стерилизованное устройство и питательные среды на ночь, свести к минимуму образование пузырьков во время эксперимента. Кроме того, дайте системе сравняться перед началом эксперимента.

Это связано с тем, что скорость потока изменяется вместе с давлением в системе. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.