Изготовление и эксплуатация Кислород Вставка для Приверженец клеточных культур

Устройство для создания гипоксии представляет собой вставку с шестью колонками, которые помещаются в лунки шестилуночного планшета. Газ проходит через микрофлюидную сеть в основании колонки и диффундирует через газопроницаемую мембрану из PDMS, разделяющую газовую сеть и культуральную среду. Данное устройство минимизирует длину пути диффузии между источником кислорода (микрофлюидной сетью в основании колонки) и клетками, что обеспечивает более быстрое установление равновесия концентрации кислорода.

Устройство также обеспечивает гораздо более точный контроль над пространственным распределением кислорода, воздействующего на клетки, который определяется конструкцией микрофлюидной газовой сети, созданной методом стандартной фотолитографии с использованием фотошаблонов. Здравствуйте, я Шон Ард из лаборатории доктора Дэвида Эдингтона на кафедре биоинженерии Иллинойского университета в Чикаго. Здравствуйте, я Элли, также из лаборатории Эдингтона.

Сегодня мы покажем вам, как изготовить, проверить и использовать специальное устройство для воздействия различных концентраций кислорода на клеточные культуры in vitro в шестилуночном планшете. Мы применяли эту процедуру в нашей лаборатории для изучения влияния кислорода на заживление ран, генерацию активных форм кислорода и миграцию клеток. Итак, приступим.

Для начала изготовления оксигенирующей вставки приготовьте полиметилсилоксан (PDMS), смешав преполимер и отвердитель в соотношении 10:1. Согласно инструкциям производителя, смесь PDMS заливают в предварительно изготовленную форму из Delrin, профиль которой имитирует форму стандартного 6-луночного культурального планшета. После отверждения при температуре 75 °C в течение ночи полученная реплика в виде массива столбиков станет первым из трех компонентов, составляющих оксигенирующую вставку, для последующего изготовления второго ключевого компонента оксигенирующей вставки.

Матрица из SU-8 подготавливается путем предварительного центрифугирования SU-8 2150. На кремниевую подложку накладывают фотошаблон, после чего SU-8 подвергают воздействию УФ-излучения через фотошаблон для создания мастер-формы с толщиной микроканала 300 µm. На матрицу из SU-8 заливают PDMS и отверждают в течение двух часов при 75 °C для получения позитивной формы, которая в конечном итоге сформирует микроканалы в основании каждого столбика.

Третий компонент устройства изготавливают путем нанесения PDMS на кремниевую подложку методом центрифугирования при 500 RPM в течение 10 секунд, затем при 900 RPM в течение 30 секунд для получения мембраны толщиной 100 мкм. Поскольку PDMS газопроницаем, кислород может поступать в микроканалы непосредственно через эту мембрану. После подготовки всех компонентов каждую соединяемую поверхность подвергают обработке кислородной плазмой в течение одной минуты.

С помощью ручного плазменного устройства сначала прикрепите шесть компонентов микроканалов к массиву столбиков, затем проколите по два отверстия в каждом столбике, которые будут служить входами и выходами газа. В завершение прикрепите мембрану к нижней части микроканала, чтобы облегчить соединение и удалить пузырьки воздуха. Обработанные плазмой поверхности прижимают друг к другу примерно на одну минуту с помощью тупого конца пинцета; между этапами склеивания следует выждать один час, чтобы убедиться, что устройство полностью соединено и может быть откалибровано.

После изготовления готового устройства необходимо откалибровать уровень кислорода, который получают клетки при использовании оксигенирующей вставки в реальных экспериментах. Для калибровки используйте флуоресцентный датчик кислорода или foxy-слайд, имеющий покрытие из флуоресцентного рутениевого красителя, который гасится кислородом. Foxy-слайды предварительно нарезаны по размеру для размещения на дне шестилуночного планшета.

Стеклянное предметное стекло следует обрезать так, чтобы оно максимально закрывало поверхность лунки. Поскольку толщина предметного стекла составляет около одного миллиметра, модифицируйте устройство для поддержания необходимого расстояния для адекватной диффузии через мембрану.

Это расстояние зависит от эксперимента, но в большинстве случаев оно должно составлять менее одного миллиметра. С помощью ручного плазменного устройства приклейте четыре вырезанных стеклянных микроскопических предметных стекла толщиной 1 мм, длиной примерно 6 мм и шириной 4 мм к нижней части устройства. Устройство будет опираться на эти опоры, расположенные на предметном стекле.

Для проверки потребления кислорода также могут быть использованы стеклянные покровные стекла для создания диффузионного зазора 0,17 мм. Добавьте по 3 мл деионизированной воды комнатной температуры в лунки шестилуночного планшета, в которых будет измеряться уровень кислорода. Поместите устройство в планшет и с помощью программного обеспечения Metamorph выберите количество и расположение нужных позиций на датчике Foxy.

Передвиньте слайд для анализа концентрации кислорода. Подсоедините трубку tai gun между баллоном с кислородом и устройством гипоксического вкладыша. Для точного контроля подачи газа используется прецизионный регулятор расхода, настроенный на скорость потока от 50 до 100 мл/мин.

Убедитесь, что регулятор точной подачи закрыт. Сначала откройте основной регулятор на верхней части баллона, затем — регулятор точной подачи. Через 15 минут снизьте скорость потока до 10–20 в минуту.

Чтобы избежать образования пузырьков в воде, в течение следующего часа внимательно следите за значением скорости потока и при необходимости вносите коррективы, так как при уравновешивании системы перепад давления будет меняться, что повлияет на скорость потока при получении изображений планшета и датчиков foxy. Используются микроскоп Olympus IX 71 с флуоресцентным оборудованием, ПЗС-камера Tiga от Q Imaging, а также программное обеспечение для сбора изображений SRV и Metamorpho. Микроскоп оснащен фильтром Olympus 3 1 0 2 0, совместимым с foxy, с длиной волны возбуждения 475 nanometers и длиной волны испускания 600 nanometers.

Для проверки времени уравновешивания и степени оксигенации устройства выберите на предметном стекле foxy три точки для измерения концентрации кислорода. Сделайте снимок предметного стекла непосредственно перед началом подачи газа. В течение 30 минут подачи газа через устройство делайте снимки с интервалом в 10 секунд, чтобы проверить гетерогенность и доставку кислорода.

Установите несколько точек с интервалом в один миллиметр по всей ширине канала и измерьте концентрацию кислорода на поверхности лунки с помощью программы Metamorph. Экспортируйте среднюю интенсивность изображения для каждой позиции и постройте график зависимости концентрации оксигенации от интенсивности флуоресценции. Постройте калибровочную кривую, аппроксимируя линейные кривые для отрезков от 0 до 10% и от 10 до 21%, чтобы установить связь между интенсивностью флуоресценции и концентрацией кислорода. Для каждой измеренной позиции необработанные данные об интенсивности могут быть экспортированы из Metamorph и далее проанализированы с помощью Microsoft Excel или другого статистического программного обеспечения.

После калибровки устройства можно приступать к экспериментам, например, к анализу заживления ран; автоклавируйте откалиброванную вставку при 121 °C в течение 15 минут не позднее чем за 24 часа до начала эксперимента и работайте с ней в ламинарном шкафу для предотвращения последующего загрязнения. Замочите стерилизованную вставку из PDMS в безсывороточной среде на 24 часа, чтобы избежать образования пузырьков газа при помещении в лунки планшета; культивируйте клетки MDCK или другие адгезивные клетки до 100% конфлюэнтности в шестилуночном планшете, затем создайте прямые царапины в монослоях с помощью наконечника пипетки P 200. Царапины имитируют раны в адгезивном монослое.

Аспирируйте культуральную среду, не повреждая монослой, и промойте его пятью миллилитрами среды. Снова проведите аспирацию и наполните лунки тремя миллилитрами безсывороточной среды. Осторожно установите устройство в планшет, следя за тем, чтобы не образовалось пузырьков воздуха.

Установка устройства под углом при вставке помогает вытеснить пузырьки воздуха с одной стороны. Будьте осторожны, чтобы не оказывать избыточного давления на устройство, так как это может деформировать PDMS достаточно сильно, чтобы раздавить лежащие под ним клетки. Поместите планшет и устройство на предметный столик микроскопа с подогревом до 37 °C и подсоедините трубки от баллона с газом-источником к входному и выходному портам устройства.

В инкубаторе для культур должна быть предусмотрена специальная отверстия для ввода трубок, и трубки должны быть подключены. После помещения устройства в инкубатор выполните ту же процедуру запуска подачи газа, что была описана ранее, для оценки заживления ран; делайте снимки клеток с интервалом в 20 минут в течение 15–18 часов, используя оборудование и программное обеспечение для визуализации, описанные ранее. Для анализа незажившей площади поверхности по истечении требуемой продолжительности эксперимента можно использовать алгоритм измерения площади царапины. Остановите подачу газа, извлеките планшет и, при необходимости, перейдите к дальнейшей обработке клеток. Устройству с гипоксической вставкой требуется менее двух минут для стабилизации уровня кислорода до 0,5%, как показано здесь.

Размер зазора у основания лунки с мембраной устройства был критическим фактором, определяющим эффективность уравновешивания, при этом при больших значениях зазора требовалось больше времени для достижения стационарных значений концентрации кислорода. Устройство также обеспечивает значительный контроль над пространственным оксигенированием в одной лунке, что позволяет создавать несколько условий и даже генерировать циклический профиль кислорода по всей поверхности лунки. Монослои клеток MDCK подвергались воздействию 10% или 21% кислорода, и площадь поверхности раны анализировалась с течением времени с использованием алгоритма MATLAB Ts для отслеживания заживления царапин.

Спустя 11 часов из 17 общего времени эксперимента, при воздействии 10% oxygen сохранилось 6.87% от площади первоначальной раны, в то время как при 21% oxygen сохранилось 64.4%. Как показано здесь, для обеих концентраций кислорода наблюдается отрицательная корреляция между концентрацией oxygen и площадью открытой раны. На протяжении всего эксперимента мы продемонстрировали способ изготовления, валидации и использования устройства с гипоксической вставкой для анализа заживления царапин. Данное устройство обладает рядом преимуществ по сравнению с другими системами оксигенации, такими как меньшая занимаемая площадь в лаборатории и гораздо более точный контроль пространственного и временного уровня оксигенации на поверхности клеток.

Это устройство может быть использовано практически в любой лаборатории, изучающей влияние кислорода или других газов, таких как углекислый газ, на клеточные культуры in vitro. При выполнении данной процедуры важно вымачивать стерилизованное устройство и культуральные среды в течение ночи, а также минимизировать образование пузырьков во время эксперимента. Кроме того, перед началом эксперимента дайте системе прийти в равновесие.

Это происходит из-за изменения скорости потока по мере выравнивания давления в системе. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.