Количественный ПЦР в реальном времени использованием Thermo Scientific Solaris КПЦР Пробирной

В данной видеостатье демонстрируется проведение ПЦР в реальном времени с использованием наборов Solaris QPCR. Наборы Solaris QPCR представляют собой ген-специфичные пары праймеров и зондов, разработанные для обнаружения всех известных сплайс-вариантов определенного гена. В универсальных условиях термоциклирования зонд Solaris содержит мотив связывания с малой бороздкой ДНК и репортер FAM на 5'-конце, а также затемнитель (dark quencher) на 3'-конце.

На этапе денатурации при проведении ПЦР в реальном времени зонд остается в растворе, и флуоресценция репортера FAM гасится. В фазах отжига и элонгации праймеры и зонд связываются с целевой последовательностью, и гаситель отделяется от FAM. Затем FAM дает сильный флуоресцентный сигнал; когда зонд диссоциирует, флуоресценция снова гаснет.

Результаты ПЦР в реальном времени демонстрируют чувствительность, специфичность и воспроизводимость этого эффективного анализа. Здравствуйте, я Джеймс Ковино из отдела исследований и разработок Thermo Fisher Scientific в Лафайетте, штат Колорадо. Сегодня мы покажем вам процедуру постановки стандартной реакции количественной ПЦР с использованием реагентов для анализа экспрессии генов Lars QPCR.

Мы используем данную процедуру в нашей лаборатории для изучения нокдауна целевых генов с помощью технологий РНК-интерференции. Итак, приступим. Тест-система Solaris qPCR assay STEM характеризуется уникальным алгоритмом, в котором используются технологии MGB и super base, что позволяет применять один удобный анализ для 98% аннотированных генов человека и мыши.

Как правило, дизайн ДНК-зондов и праймеров ограничен температурой плавления зонда, которая определяется количеством и типом оснований. Более длинные и богатые GC-парами последовательности имеют более высокую температуру плавления. Фрагмент, связывающийся с малой бороздкой и используемый в зондах Solaris, встраивается в малую бороздку спирали ДНК и стабилизирует взаимодействие зонда с целевой последовательностью.

Это повышает температуру плавления, что позволяет использовать более короткие зонды. Алгоритм Solaris также селективно внедряет модифицированные нуклеотиды, называемые супербазами, для повышения стабильности AT-связей и устранения самоассоциации GG в гуанин-богатых последовательностях. Это позволяет использовать целевые последовательности, которые в противном случае пришлось бы исключить.

Повышенная гибкость подбора последовательностей, обеспечиваемая использованием данных технологий, позволяет разрабатывать наборы праймеров и зондов, распознающих все известные сплайс-варианты одного гена. Следует отметить, что везде, где это было возможно, в целевой участок были включены области, перекрывающие границы экзонов, для повышения специфичности путем предотвращения амплификации контаминирующей геномной ДНК; полученные наборы праймеров и зондов были проанализированы с помощью BLAST по трем различным базам данных — геномной, транскриптомной и базе псевдогенов — для обеспечения специфичности. Кроме того, наборы праймеров и зондов Solaris были полностью оптимизированы таким образом, что условия циклирования для всех анализов QPCR идентичны, что позволяет оценивать экспрессию различных транскриптов в рамках одного цикла ПЦР.

Для начала планирования эксперимента qPCR определите реагенты, необходимые для проведения qPCR исследуемого гена, используя интеллектуальный поиск продуктов, который доступен по адресу thermo.com/solaris. Нажмите в поле поискового запроса и выберите соответствующий целевой организм. Интеллектуальный поиск продуктов поддерживает работу со многими различными идентификаторами генов.

Введите один из предложенных поисковых запросов для интересующего гена, затем нажмите «поиск», найдите нужный ген и нажмите «выбрать» (select) в левой части экрана. Откроется окно со списком доступных реагентов для данного гена. В разделе Solaris gene expression assay перейдите на вкладку «qPCR-детекция» (QPCR detection).

Представлен оптимально разработанный праймерный анализ с использованием зонда Solaris. Этот один анализ позволит обнаружить все известные сплайс-варианты интересующего гена. После определения подходящего реагента для праймера выберите в меню амплификатор для QPCR и определите совместимую мастер-смесь: либо мастер-смесь с отдельным флаконом с пассивным референсным красителем ROX, либо смесь ROX, либо смесь с низким содержанием ROX.

В данной работе будет использоваться прибор Roche LightCycler 480, поэтому будет применяться набор Master Mix PLUS. Также важно убедиться, что в исследование включен соответствующий референсный ген. После получения всех реагентов Solaris qPCR будет использоваться B2M.

Их следует хранить при температуре -20 °C до использования. Реагенты стабильны в течение как минимум 12 месяцев. Следует избегать повторных циклов замораживания и оттаивания.

Подготовьте кДНК для кПЦР, проведя реакции обратной транскрипции образцов РНК. После подготовки кДНК разморозьте на льду реагенты Solaris assay и мастер-микс. Мастер-микс содержит все компоненты для количественной ПЦР, за исключением ген-специфичного набора; компоненты матрицы включают термостат, ДНК-полимеразу dn, TPS rocks.

Если прибор для QPCR требует использования специальных условий и проприетарного реакционного буфера, содержащего внутренний синий краситель, также подготовьте воду степени чистоты для ПЦР и планшеты для QPCR. После размораживания растворов перемешайте их легким постукиванием, затем кратковременно центрифугируйте, чтобы предотвратить потерю реагентов. Далее в пробирке объемом 15 мл приготовьте 1х смесь для анализа Solaris QPCR и мастер-микс.

Смешайте для требуемого количества образцов, которые будут нанесены на планшет с 384 лунками, 5 µL 2x мастер-микса, 0,5 µL 20X реагента Solaris assay и воду степени очистки для ПЦР таким образом, чтобы конечный объем в каждой лунке составил 10 µL. Перед добавлением кДНК обязательно подготовьте объем смеси, достаточный для трех повторностей каждого образца, включая контроль без матрицы (NTC) и контроль без обратной транскриптазы (no RT) для проверки реагентов на наличие загрязнений или contaminating genomic DNA соответственно. Затем перенесите смесь в стерильный резервуар.

Затем с помощью многоканального дозатора перенесите соответствующий объем готовой мастер-смеси (1x) в нужные лунки ПЦР-планшета. При использовании белых планшетов внутренний синий краситель, входящий в состав мастер-смеси, поможет контролировать процесс дозирования. На одном планшете можно анализировать несколько библиотек кДНК и референсных генов, поскольку условия циклирования для всех образцов идентичны.

После добавления 1x мастер-микса в соответствующие лунки, добавьте в каждую лунку разведенную матрицу CD NA так, чтобы конечный объем составил 10 microliters; перемешайте путем всасывания и вытеснения жидкости пипеткой. Плотно закройте планшет с помощью адгезивной или термосвариваемой пленки, как показано здесь.

Поместите планшет в центрифугу и центрифугируйте его, чтобы осадить реагенты на дно лунок и удалить пузырьки воздуха, которые могут помешать программе считывания флуоресценции. В термоциклере полимераза с «горячим стартом», входящая в состав мастер-микса Solaris QPCR, должна быть активирована при 95 °C в течение 15 минут (один цикл), затем следует 40 циклов, включающих денатурацию при 95 °C в течение 15 секунд и отжиг с элонгацией при 60 °C в течение 60 секунд. Данный протокол одинаков для всех анализов Soliris QPCR, независимо от амплифицируемого гена.

Наконец, поместите планшет в прибор для QPCR и запустите программу. На данном рисунке показана высокая эффективность тестов Solaris: было проведено амплифицирование 10 десятикратных разведений синтетической ДНК или кДНК с использованием тестов Solaris QPCR для анализа экспрессии генов CDC 20 и F two RL one; кривые амплификации в логарифмическом масштабе и стандартные кривые для десятикратных разведок (log 10) демонстрируют высокую эффективность анализа даже при низких концентрациях исходного материала.

Эффективность каждого анализа оценивается по значению эффективности в квадрате, динамическому диапазону по шкале до 10, десятикратным разведениям (log 10) и нижнему пределу обнаружения. Представленные здесь данные демонстрируют воспроизводимость анализов Solaris. В данном случае аликвоты кДНК амплифицировали в двух географически удаленных лабораториях, используя наборы для анализа экспрессии генов Solaris QPCR и мастер-микс.

Для двух целевых генов в обеих лабораториях были рассчитаны одинаковые уровни экспрессии. Мы только что продемонстрировали вам способ постановки стандартной реакции QPCR с использованием реагентов для анализа экспрессии генов Solaris QPCR. При проведении этого эксперимента важно помнить о необходимости приготовления мастер-миксов с правильной конечной концентрацией реагентов, а также о включении соответствующих биологических и/или технических повторностей.

Кроме того, крайне важно настроить прибор для QPCR с правильными условиями термоциклирования для Solaris. На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.