Визуализация РНК Локализация в Xenopus Ооцитов

При этой процедуре флуоресцентно мечается РНК. Транскрипты вводятся в XUS Cytes и контролируется их локализация. Во-первых, РНК помечена флуоресцентными нуклеотидами.

В реакции транскрипции in vitro РНК затем загружается в аппарат для микроинъекций. Ооциты помещаются на инъекционную чашку и осторожно вводятся в микроинъекции. Наконец, ооциты культивируют, чтобы обеспечить локализацию РНК до получения изображений на конфокальном микроскопе.

Здравствуйте, я Джеймс Гагнан из лаборатории доктора Кимберли Мэллори на кафедре молекулярной биологии, клеточной биологии и биохимии в Университете Брауна. Сегодня мы покажем вам процедуру визуализации локализации субклеточной РНК в ооцитах Xap. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения архитектуры РНК и белковых факторов, необходимых для локализации РНК на ранних этапах развития позвоночных.

Итак, приступим. Чтобы начать эту процедуру, транскрибируйте мРНК, которая помечена как радиоактивно, так и флуоресцентно, как описано в сопроводительном письменном протоколе. Добавьте DS, чтобы разрушить ДНК матрицы, а затем остановите реакцию, добавив ЭДТА.

Удалите неинкорпорированные нуклеотиды и другие малые молекулы путем вращения через колонку G 50. Затем РНК концентрируется путем осаждения этанола, промывается и ресуспендируется. После определения концентрации методом сцинтилляционного подсчета разбавьте РНК до 50 наномоляров и храните в пяти микролитрах аликвот при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Когда вы будете готовы к выполнению микроинъекции, разморозьте Eloqua меченой РНК-денатурации при 70 градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем открутите в течение 10 минут на максимальной скорости в микроцентрифуге при комнатной температуре, чтобы удалить твердые частицы и удержать на льду. Далее изолируйте из клеток обрезайте кусочки xap post lavu яичника в 50 миллилитровую коническую двойку, содержащую 25 миллилитров по три миллиграмм на миллилитр.

Коллагеназа в 0,1 молярном буфере фосфата калия при pH 7,4. Осторожно встряхните при температуре 18 градусов Цельсия из-за вариаций от партии к партии. Время лечения коллагеназой может варьироваться, и его следует тщательно контролировать с помощью визуального осмотра.

Чтобы обеспечить дефолиацию, продолжайте встряхивание в течение 15 минут или до тех пор, пока ооциты не будут заметно отделены от яичников, позвольте ооцитам осесть на дно конической трубки. Удалите раствор и замените его буфером MBSH. Повторите это, постирайте еще два раза, всего три стирки.

Далее вручную отсортируйте третью-четвертую стадию CYTES и буфер MBSH под стандартным световым микроскопом. Клетки третьей стадии полностью непрозрачные, но белого цвета. В то время как четвертая стадия циты немного больше и испещрены пигментом.

Циты, которые слегка прозрачны, слишком молоды, а циты, которые полностью пигментированы или демонстрируют поляризованное распределение пигмента, слишком стары. Наконец, подготовьте иглы к микроинъекции, используя капилляры длиной три с половиной дюйма, вытягивая и снимая фаску, чтобы получить иглы с внешним диаметром примерно 0,05 миллиметра. Теперь, когда ооциты мРНК и иглы готовы, приступайте к микроинъекции.

Начните с калибровки иглы с помощью дезистой воды, чтобы доставить два нанометра за одну инъекцию. Фронт. Загрузите иглу с помощью микроинжектора, управляемого газом, и откалибруйте размер капли с помощью микрометра: после калибровки фронтальная загрузка РНК для введения в иглу. Далее поместите отсортированные ооциты на чашку для инъекций В буфере MBSH чашка содержит слой черного поролона.

Белый цит хорошо выделяется на черном фоне. Затем осторожно вводят в каждую яйцеклетку два литра РНК на 50 наномоляров. Обязательно вводите каждый ооцит только один раз и регулярно проверяйте иглу на предмет закупорки после завершения инъекции.

Изгоните оставшуюся РНК, промойте иглу дезистой водой и загрузите следующую РНК для инъекции. После инъекции введенные циты переводятся в лунку стерильной 24-луночной пластины до тысячи. CYTES можно культивировать в каждой лунке.

Удалите буфер и замените его 400 микролитрами среды для культуры цитов на лунку. Затем поместите планшет для культивирования в пластиковый контейнер с влажным бумажным полотенцем для поддержания влажной среды во время культивирования, инкубируйте ооциты при температуре 18 градусов Цельсия в период от восьми до 48 часов после желаемого инкубационного периода. Ооциты могут быть подготовлены для микроскопии после инкубации введенных ооцитов.

Отсортируйте все мертвые ооциты и поместите выжившие ооциты в стеклянные флаконы. Выживаемость более 90% ооцитов обычно наблюдается. Замените буфер на фиксатор M-E-M-F-A и покачивайте циты в течение 20 минут.

Защищайте ооциты от солнечного света во время фиксации после завершения периода фиксации. Промойте ооциты, удалив фиксатор и заменив его таким же объемом MBSH буфера. Повторите эту стирку еще раз, всего два мытья.

Далее промойте ооциты в безводный метанол. Сначала удалите половину объема и замените его метанолом. Повторите это еще два раза.

После этих промывок удалите весь раствор и замените его метанолом. Повторите эту промывку метанолом еще раз. Неподвижные и обезвоженные ооциты могут храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к визуализации.

Перед визуализацией добавьте очищающую среду Marie's в флюорографическую чашку со стеклянным дном WPI, чтобы покрыть поверхность изображения. Осторожно переносите ооциты из метанола во флюоротарелку, минимизируя объем метанола. Изображение ооцитов на инвертированном конфокальном микроскопе дают как Zeiss LSM five 10, так и aica TCSs P. Хорошие результаты. Теперь мы покажем некоторые репрезентативные изображения локализации субклеточной РНК сразу после микроинъекции: флуоресцентную РНК можно увидеть в ядре после восьми часов культивирования флуоресцентно меченного контроля.

Можно увидеть, что РНК равномерно распределены в цитоплазме ооцита. Тем не менее, флуоресцентно меченая РНК, содержащая последовательности, которые рекрутируют транспортный механизм, может быть замечена в процессе субклеточной локализации к растительному полюсу ооцита. Мы только что показали вам, как вводить флуоресцентно меченые РНК в циты и наблюдать за локализацией РНК с помощью конфокальной микроскопии.

При выполнении этой процедуры важно использовать растворы, обработанные deci, чтобы избежать загрязнения РНК культурой, вашими цитами в OCM, содержащими антибиотики, и по возможности защитить циты от солнечного света, чтобы избежать фотообесцвечивания. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.