Получение гемоциты от Гавайских бобтейл Squid Euprymna scolopes И наблюдая за их соблюдение Симбиотические и ненасилия в симбиотических бактерий

После того как взрослых кальмаров-бобтейлов извлекли из аквариумов и подвергли анестезии раствором фильтрованной морской воды с 2% ethanol, из них производят кровопускание через цефалический кровеносный сосуд. Гемолимфа, извлеченная с помощью шприца с иглой калибра 26,5, имеет синий цвет.

Из-за присутствия гемоцианина гемоциты разводят до необходимой концентрации и переносят аликвотами на восьмилунковый предметный покровный стеклo. После того как гемоциты прикрепятся к покровному стеклу, их окрашивают CellTracker Orange, флуоресцентным красителем, и подвергают воздействию бактерий, меченных GFP, которые можно визуализировать с помощью флуоресцентного микроскопа. Здравствуйте, я Спенсер Олм с кафедры молекулярной и клеточной биологии Университета Коннектикута.

С вами Эндрю Коллинз из NY Home Lab. Сегодня мы продемонстрируем процедуру извлечения гемолимфы или крови из гавайского кальмара-бобтейла. Вы подготавливаете этот образец.

Кальмары-бобтейлы — ночные животные, обитающие у берегов Гавайев вблизи коралловых рифов; они используют свет, вырабатываемый их симбионтами, для маскировки в ночное время, когда выходят на охоту за своей основной добычей — креветками. В лабораторных условиях мы используем этот симбиоз для изучения того, как полезные бактерии колонизируют ткани животных. Данная процедура применяется в нашей лаборатории для исследования взаимодействий между компонентами врожденной иммунной системы хозяина и его биолюминесцентным бактериальным партнером VIO ide.

Приступим к работе. Перед забором гемолимфы подвергните одну взрослую кальмаров анестезии в одном литровом стакане, содержащем свежеприготовленный раствор 2% этанола в 500 миллилитрах фильтр-стерилизованной искусственной морской воды. Через 10 минут кальмар будет медленно плавать и перестанет активно реагировать на прикосновения.

Тем не менее, все еще должно наблюдаться продолжающееся дыхание, о чем свидетельствует движение мантии, а также активность хроматофоров, указывающая на работу пигментных клеток. Налейте часть стерильного раствора морской воды с этанолом из стакана в стандартный восковой диссекционный лоток и погрузите кальмара в лоток вентральной стороной вверх. Используя один стандартный наконечник для пипетки объемом 200 µL, оттяните воронку и мантию, чтобы обнажить главный головной кровеносный сосуд, расположенный между двумя глазами.

Используйте стерильный шприц с иглой калибра 26,5 для пункции цефалического кровеносного сосуда и заберите от 50 до 100 µL гемолимфы или от 10 до 20 µL. Если животное будет использоваться в качестве донора несколько раз, поместите гемолимфу в стерильную пробирку объемом 1,5 мл на льду. Обратите внимание, что при правильном выполнении этого этапа кровь кальмара должна иметь темно-синий цвет.

Перенесите животное в резервуар с обычной морской водой для восстановления, затем центрифугируйте гемолимфу в микроцентрифуге при комнатной температуре для осаждения гемоцитов и слейте супернатант. Ресуспендируйте гемоциты в 500 µL раствора Рингера для кальмаров для промывки. Затем снова центрифугируйте пробу для осаждения клеток и удалите супернатант.

Наконец, ресуспендируйте гемолимфу в растворе Рингера для кальмаров. Определите концентрацию клеток с помощью гемоцитометра. Затем добавьте примерно 2000 клеток в каждую камеру покровного стекла.

Дайте клеткам прикрепиться к стеклу в течение примерно 10 минут. При такой плотности гемоциты должны образовать равномерный монослой на поверхности стекла. Держите гемоциты на льду, пока готовите бактерии в орбитальном шейкере при температуре 28 °C.

Вырастите один или несколько штаммов бактерий Vireo, содержащих ген зеленого флуоресцентного репортера, до средней логарифмической фазы в морской среде с тритоном. С помощью спектрофотометра измерьте оптическую плотность культуры при 600 нм для определения плотности клеток; осадите бактерии путем центрифугирования, удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 1 мл раствора Рингера для кальмаров. Добавьте бактерии к гемоцитам.

В камерные предметные стекла нанесите по 100 000 бактерий в каждую камеру. Инкубируйте стекла при комнатной температуре в течение одного часа. Для обеспечения максимального связывания добавьте краситель cell tracker orange до конечной концентрации 0.005% для окрашивания цитоплазмы.

Инкубируйте в течение 30 минут, затем промойте 150 µL свежего раствора Рингера для кальмаров. Используя конфокальный микроскоп, осмотрите окрашенные гемоциты и ассоциированные с ними бактерии, подсчитайте количество бактерий на всей поверхности гемоцита. Теперь мы покажем вам репрезентативные изображения гемоцитов, зараженных помеченной GFP несимбиотической бактерией Vibrio harveyi и природным симбионтом кальмара Vibrio fischeri.

На данном изображении представлен участок гемоцитов, в который не вводились бактерии. Клетка окрашена в красный цвет и находится в активированном состоянии, поэтому видны ее псевдоподиеподобные отростки.

При воздействии на гемоциты бактерий-симбионтов *Vibrio fischeri* наблюдается связывание лишь нескольких бактерий с поверхностью клетки. Однако при воздействии несимбиотических бактерий *Vibrio harveyi* на гемоциты связывается значительно большее количество бактерий. Мы продемонстрировали способ извлечения гемолимфы из кальмара-каракатицы, выделения гемоцитов и их использования в экспериментах по определению адгезии бактерий к клеткам этого кальмара.

Данный протокол может быть модифицирован для иммунохимии путем фиксации гемоцитов после их прикрепления к поверхности покровного стекла. Также возможна экстракция РНК, ДНК и белков после получения гемоцитов из организма животного. На этом всё.

Спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах.