Окно в микромире: Простой микрожидкостных систем для изучения микробных транспорта в пористых средах

Мы демонстрируем, что благодаря использованию устройств с экочипами физические структуры и напорные головки могут оставаться постоянными или изменяться. В то время как влияние свойств поверхностной химии жидкости или характеристик частиц или микробов систематически исследуется с помощью экспериментов по переносу с использованием непатогенного зеленого флуоресцентного белка, экспрессирующего бактериальный штамм VIO, мы иллюстрируем важность структуры среды обитания, условий течения и размера инокулюма на фундаментальные явления переноса. Микрофлюидное программное обеспечение для захватывающего взгляда на скрытый мир.

Здравствуйте, наш Дмитрий Маркер из Института интегративного образования по восстановлению биосистем Вандербильта при Университете Вандербильта. Меня зовут Дэвид Шафер, я инженер по исследованиям и разработкам в Viro Laboratories. Здравствуйте, меня зовут Лесли Шо (Leslie Sho) с факультета химических материалов и биомолекулярной инженерии Центра экологических наук и инженерии Университета Коннектикута, и я добавил Dicot также из зебры.

Сегодня мы покажем вам процедуру создания модульных микрофлюидных массивов сред обитания для фундаментальных экологических наук и инженерных исследований. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для исследования влияния структур микрометрового масштаба на взаимодействия микроорганизмов в лесных средах. Итак, приступим.

Первым шагом в создании микрофлюидного устройства является рисование двухмерного макета устройства в компьютерном черчении или программе CAD. Мы использовали AutoCAD, но доступны и другие программы для рисования, такие как подсказка или рисование кораллов. Программное обеспечение позволяет проектировщику точно воспроизводить физические структуры по всему макроскопическому полю, в то время как отдельные особенности определяются с разрешением менее пяти микрон.

На основе чертежа САПР создается фотографическая маска. Мы используем хромовую маску производства Advanced Reproductions Corporation, северная часть штата Массачусетс. Следующие несколько этапов производства микрофлюидных устройств происходят в чистом помещении для создания мастера.

Чистая кремниевая пластина покрывается фоторезистом в спин-кодере. Сначала пластина прикрепляется к платформе спин-кодера и на центр пластины заливается несколько граммов фоторезиста SU 8 20 25. Затем пластина вращается в течение начального 15-секундного цикла нанесения покрытия со скоростью 500 об/мин, за которым следует цикл тонкого покрытия со скоростью 4000 об/мин в течение 35 секунд.

После отжима пластину помещают на горячую плиту на 10 минут при температуре 95 градусов Цельсия для испарения избытка растворителя. Последним этапом подготовки является снятие краевой бусины. Это делается путем возврата пластины в спин-маркер и подачи постоянного потока средства для удаления скорости края SUA на внешний край пластины с покрытием.

Следующим шагом является моделирование фоторезиста путем избирательного воздействия ультрафиолетового света. Сначала пластина с покрытием помещается на плоскую поверхность, а хромированная маска размещается прямо сверху. Рубилитовая красная маскирующая пленка блокирует перенос узоров за пределы нужной зоны.

Затем доза ультрафиолетового излучения в размере 300 миллиметров JUUL на квадратный сантиметр подается на покрытую пластину через маску с помощью системы точечного переноса. Наконец, пластина выпекается в течение 15 минут при температуре 95 градусов Цельсия, чтобы сшить области фоторезиста, подверженные воздействию света, делая их нерастворимыми. Последним шагом в создании мастер-модели является удаление несшитых областей фоторезиста, оставляющих после себя рельефные структуры.

Во-первых, пластина еще раз возвращается в спин-кодер и покрывается раствором разработчика. Проявитель оставляют на пластине с покрытием примерно на пять минут, а затем откручивают, в результате чего на пластине образуется четко видимый рисунок. Любые оставшиеся остатки смываются путем распыления изопропилового спирта на вращающуюся пластину.

Для этого шага мы используем скорость вращения 2200 об/мин в течение примерно пяти-10 секунд. Наконец, готовый мастер сушат с помощью струи газообразного азота и хранят в посуде до тех пор, пока он не понадобится для отливки устройства. Мы изготавливаем микрофлюидные устройства с использованием полиметилалана силиконового эластомера.

Во-первых, основной материал и отвердитель доставляются в пластиковом стаканчике в соотношении 10 к одному. Далее смесь перемешивается. Энди пузырился, используя смеситель-кондиционер thinky AR 100.

После завершения цикла жидкий PDMS равномерно заливается на мастер-сервер. Чашка, содержащая мастер и неотвержденный PDMS, затем помещается в вакуумную камеру для дегазации. Полимерные пузыри появляются практически сразу.

Дегазация продолжается до тех пор, пока все пузырьки не исчезнут. Блюдо помещается в духовку с температурой 65 градусов Цельсия не менее чем на четыре часа, чтобы обеспечить полное сшивание полимеров. Затем отвержденный PDMS аккуратно извлекается из многоразового мастера.

Первые четыре края вырезаются хорошо за пределами узорчатой области с помощью скальпеля, устройство отслаивается от узорчатой пластины с помощью пинцета. При желании края устройства могут быть обрезаны с помощью ножниц. Подсекция устройства может быть отделена от остальной части формованного устройства PDMS.

Затем в PDMS проделываются отверстия для доступа. Мы используем биопсийные пуансоны, которые коммерчески доступны в нескольких различных размерах, устанавливаемые на небольшую беседку. Прессовые стержни PDMS удаляются с помощью щипцов.

Наконец, обрезанное и перфорированное устройство очищается с помощью изопропилового спирта и полипропиленового тампона с пенопластовым наконечником. Устройство высушивают с помощью азота, затем помещают в духовку, чтобы удалить все следы растворителя. Последним шагом в создании микрофлюидного устройства является приклеивание PDMS к подложке из стекла, а затем сначала заполнение жидкостью.

Устройство PDMS и предметное стекло размещаются с расстоянием между связующими поверхностями в плазменный очиститель. В этом эксперименте мы используем очиститель плазмы Herrick PDC 32 G. Как только вакуум устанавливается и видна сине-фиолетовая плазма, таймер устанавливается на 30 секунд.

Генератор плазмы выключен. В камеру повторно создается давление, и устройство и ползунок, извлеченные из камеры, и склеивающие поверхности соприкасаются. При извлечении активированных компонентов из камеры важно действовать быстро, чтобы поверхности оставались активированными.

Мягкое давление помогает обеспечить хорошее сцепление. Качество связки проверяют, потянув щипцами за угол. Затем гидрофильная внутренняя часть может быть легко заполнена водным раствором, таким как буферная среда или деионизирована.

Водный флюид подается в каждую исходную скважину и через соответствующую микропористую проточную ячейку. После того, как все камеры заполнены, на все устройство наносится тонкий слой отвержденного PDMS, чтобы замедлить испарение и сохранить стерильность. Чтобы откалибровать поток под давлением в устройстве, предварительно загрузите микроструктурированные проточные ячейки деионизированной водой, разместите модуль потока, который действует как интерфейс подачи жидкости и стерильное уплотнение в верхней части устройства.

Этот модуль потока может использоваться отдельно или быть подключен к внешнему резервуару, содержащему жидкость, например, к пластиковому шприцу. Подсоедините резервуар с жидкостью, такой как пластиковый шприц или модуль потока, к входному отверстию. Хорошо поддерживайте высоту жидкости в резервуаре выше высоты нижележащей по течению.

Разница в высоте между резервуаром перед резервуаром и каждой выходной скважиной определяет движущую силу потока, управляемого давлением, для количественной оценки расхода через устройства. Игла 25-го калибра с тупым концом используется для сбора проб из расположенных ниже по течению скважин через равные промежутки времени. Например, мы собираем образцы каждые 15-20 минут, тщательно отмечая фактическое время, прошедшее между образцами.

Вес шприца фиксируется до и после отбора проб на аналитических весах. Зависимость объема агрегата от времени агрегата отображается на графике с наклоном, равным среднему массовому расходу. Большое поперечное сечение входного резервуара по отношению к выходным скважинам помогает предотвратить значительное изменение расхода при движении жидкости через устройства, что позволяет построить график зависимости объема отбора проб по оси Y от времени отбора проб по оси X.

В простой программе построения графиков, такой как Excel, для получения наклона линии наклон используется для среднего объемного расхода. Разбавленный раствор трех микромолярных флуоресцентных латексных шариков с карбокси, YG и плоской поверхностью YG используется для визуализации течения и изучения поверхностных взаимодействий. Сначала готовится раствор гранул в деионизированной воде с концентрацией 0,01% твердых веществ.

Раствор добавляется в скважины выше по течению, а модуль потока снова присоединяется к zu. Поток шариков визуализируется в течение одного часа и регистрируется примерно каждые 10 минут на флуоресцентном микроскопе Zeiss AIOt 25, оснащенном монохромной камерой MITx BCEB 0 1 3 U. Отдельные кадры захватываются в быстрой последовательности и собираются в видеоролики с помощью такой программы, как Image J, с флуоресцентным освещением и освещением проходящим светом.

Видны бусины и структуры. Когда проходящий свет блокируется, видны только яркие флуоресцентные шарики. Неподвижные шарики, нанесенные вдоль нижней поверхности или прикрепленные к коллекторам, заметны по всему устройству.

Для экспериментов с использованием живых бактерий готовят культуру типа Vibrio, непатогенную зеленую флуоресцентную белок, экспрессирующую белок. Сначала подвойную культуру вынимают из глубокого свободного хранилища. Колбу со стерильной питательной средой LB инокулируют исходной культурой.

С помощью одноразовой инокуляционной петли колбу инкубируют в течение ночи с встряхиванием до получения культуры в неподвижной фазе с концентрацией примерно от 10 до девяти клеток на миллилитр. В зависимости от области применения начальная концентрация бактерий может быть определена более точно. Подготавливается микрофлюидное устройство, заполненное стерильным буфером.

Затем стерильная жидкость из начальных лунок опорожняется и заменяется 20 микролитрами бактериальной культуры. С помощью пипетки бактерии засеваются в устройство с помощью мягкого отсасывания шприцем на выходных лунках После инкубации количество бактерий в лунках можно определить путем количественного определения интенсивности флуоресценции каждой лунки после колонизации. Входной колодец перед входом, как и раньше, опорожняется и заменяется буфером, промытым 25 частями на тысячу солей.

Искусственная морская вода под щадящим давлением подается на скважины выше по течению с помощью шприца, промывая отдельные проточные ячейки от 20 до 40 микролитров буферного раствора. Это примерно в 100-200 раз больше плохого объема микрофлюидной части почвы проточной ячейки после первоначальной промывки. Долговременная перфузия бактерий через пористую среду достигается за счет использования модуля потока точно так, как показано ранее.

Флуоресцентные изображения роста и переноса бактерий в белом свете могут быть измерены с течением времени. В этом эксперименте изображения делаются каждые 15-20 часов в течение семи дней с помощью цветной пятиохлаждаемой ПЗС-камеры с чернилами Q. Наши устройства также могут быть использованы для исследования влияния физической структуры среды обитания на обеспечение бактерий убежищем от хищничества простейших. Видеть.

Здесь бактерии в микропористой проточной ячейке с гораздо более крупными реснитчатыми простейшими эуло, видимыми в устройстве, питаются бактериями. При анализе потока жидкости в микрофлюидном устройстве мы обнаружили, что средний расход составляет 0,71 микролитра в минуту для напора с давлением 40 мм. При увеличении напора давления до 60 миллиметров расход увеличился пропорционально до 1,04 микролитра в минуту.

При использовании в приборе шариков с различным составом поверхности мы наблюдаем большее накопление некарбоксилированных шариков на поверхностях прибора. В то время как бусины диаметром от 6 до 10 миллиметров с гораздо большей вероятностью застревают в меньших поровых отверстиях. Более высокая скорость потока, вызванная более высоким гидростатическим давлением, привела к снижению удержания и уноса валиков, как и следовало ожидать при анализе роста бактерий в микрофлюидном устройстве eco chipp.

Отметим качественные различия в интенсивности изображения в разных секторах устройства. Интенсивность флуоресценции может быть количественно определена как косвенный показатель микробной биомассы в канале. В текущих экспериментах мы наблюдаем, что непрерывные силы сдвига в условиях низкого потока, по-видимому, вызывают бактериальную агрегацию и образование стад, как видно на этих изображениях. Мы только что показали вам, как создавать и использовать простые микрофлюидные устройства для измерения размера частиц, переноса столкновений через пористую среду или для исследования микробных взаимодействий в микроструктурированных средах обитания.

При проведении исследований с использованием проточных ячеек важно учитывать плавучесть гранул и химический состав поверхности коллоидов и коллекторов. При уменьшении масштаба до микрофлюидного режима поверхностные эффекты могут доминировать над наблюдаемыми явлениями. Практически любая физическая структура может быть включена в конструкцию микрофлюидных проточных ячеек.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.