Окно в микромире: Простой микрожидкостных систем для изучения микробных транспорта в пористых средах

Мы демонстрируем, что с помощью устройств eco chip можно поддерживать постоянными или изменять физическую структуру и напоры давления. В то время как влияние свойств жидкостей, химии поверхности или характеристик частиц и микробов систематически исследуется в ходе экспериментов по транспорту с использованием непатогенного бактериального штамма VIO, экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок, мы иллюстрируем важность структуры среды обитания, условий потока и размера инокулята для фундаментальных явлений транспорта. Микрофлюидное программное обеспечение открывает убедительный вид на скрытый мир.

Здравствуйте, я Димитри Маркер из Института восстановительного образования интегративных биосистем при Университете Вандербильта. Я Дэвид Шейфер, инженер по исследованиям и разработкам в Viro Laboratories. Здравствуйте, я Лесли Шо с кафедры химического материаловедения и биомолекулярной инженерии Центра экологических наук и инженерии Университета Коннектикута. И я Эдди Дикот, также из Viro Laboratories.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру создания модульных массивов микрофлюидных сред обитания для базовых исследований в области экологической науки и техники. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения влияния структур микронного масштаба на транспортные взаимодействия микроорганизмов в лесных средах. Итак, приступим.

Первым этапом создания микрофлюидного устройства является разработка его двухмерного чертежа в программе автоматизированного проектирования или CAD-системе. Мы использовали AutoCAD, однако доступны и другие программы для черчения, такие как Clue-in или CorelDraw. Данное программное обеспечение позволяет проектировщику точно воспроизводить физические структуры в макроскопическом поле, при этом отдельные элементы определяются с разрешением менее 5 µm.

На основе CAD-чертежа создается фотошаблон. Мы используем хромовую маску производства Advanced Reproductions Corporation, штат Массачусетс. Последующие этапы изготовления микрофлюидного устройства проводятся в «чистой комнате» для создания мастер-формы.

Чистая кремниевая пластина покрывается фоторезистом в центрифуге для нанесения покрытий. Сначала пластину закрепляют на платформе центрифуги, и в центр пластины наливают несколько граммов фоторезиста SU 8 20 25. Затем пластину вращают в течение начального цикла распределения продолжительностью 15 секунд при 500 RPM, после чего следует цикл нанесения тонкого слоя при 4 000 RPM в течение 35 секунд.

После центрифугирования пластина помещается на нагревательную плитку на 10 минут при температуре 95 °C для испарения излишков растворителя. Последним этапом подготовки пластины является удаление краевого наплыва. Для этого пластина возвращается в центрифугу для нанесения покрытий, после чего на внешний край пластины с покрытием подается непрерывная струя средства для удаления краевого наплыва SUA.

Следующим этапом является формирование рисунка на фоторезисте путем селективного облучения УФ-светом. Сначала покрытая пластина помещается на плоскую поверхность, и сверху на нее непосредственно накладывается хромированная маска. Красная маскирующая пленка Rubylith предотвращает перенос рисунка за пределы требуемой области.

Затем на покрытую пластину через маску с помощью системы позиционирования облучения подается доза УФ-света 300 mJ/cm². В завершение пластину высушивают в течение 15 минут при 95 °C для сшивания подвергнутых воздействию света участков фоторезиста, что делает их нерастворимыми. Последним этапом создания мастер-формы является удаление несшитых участков фоторезиста, в результате чего остаются приподнятые рельефные структуры.

Сначала пластину снова помещают в центрифужный кодер и покрывают раствором проявителя. Проявитель оставляют на покрытой пластине примерно на пять минут, после чего его удаляют центрифугированием, в результате чего на пластине проявляется четкий рисунок. Остатки раствора смывают, разбрызгивая изопропиловый спирт на вращающуюся пластину.

На данном этапе мы используем скорость центрифугирования 2200 RPM в течение примерно 5–10 секунд. В завершение готовая мастер-форма высушивается потоком азота и хранится в чашке Петри до момента отливки устройства. Мы изготавливаем микрофлюидные устройства с использованием силиконового эластомера полиметилсилана.

Сначала в пластиковый стакан помещают базовый материал и отвердитель в весовом соотношении 10:1. Затем смесь перемешивают. Для удаления пузырьков воздуха использовали центрифужный миксер Thinky AR 100.

По завершении цикла жидкий PDMS равномерно разливают по мастер-форме. Затем чашку с мастер-формой и неотвержденным PDMS помещают в вакуумную камеру для дегазации. Пузырьки полимера появляются почти мгновенно.

Дегазацию продолжают до полного исчезновения всех пузырьков. Чашку помещают в горизонтальный oven при температуре 65 °C минимум на четыре часа для полного завершения сшивания полимера. Затем отвержденный PDMS осторожно отделяют от многоразовой формы.

Сначала скальпелем делают четыре надреза далеко за пределами структурированной области, затем с помощью пинцета устройство отделяют от структурированной пластины. При необходимости края устройства можно подрезать ножницами. От основного формованного устройства из PDMS может быть отделена его часть.

Затем в PDMS пробивают технологические отверстия. Для этого используются коммерчески доступные биопсийные панчи различных размеров, закрепленные на небольшом стержне. Извлеченные цилиндры PDMS удаляют с помощью пинцета.

Наконец, обрезанное и пробитое устройство очищают с помощью изопропилового спирта и полипропильного тампона с поролоновым наконечником. Устройство высушивают потоком азота, после чего помещают в печь для удаления всех остатков растворителя. Заключительным этапом изготовления микрофлюидного устройства является прикрепление PDMS к стеклянной подложке с последующим заполнением устройства жидкостью.

Устройство из PDMS и предметное стекло помещают в установку для плазменной очистки поверхностями для склеивания вверх. В данном эксперименте мы используем установку для плазменной очистки PDC 32 G herrick. После создания вакуума и появления видимой сине-фиолетовой плазмы таймер устанавливается на 30 секунд.

Генератор плазмы выключают. В камеру снова подают давление, после чего устройство и слайдер извлекают из камеры и приводят соединяемые поверхности в контакт. При извлечении активированных компонентов из камеры важно действовать быстро, чтобы поверхности оставались активированными.

Легкое нажатие помогает обеспечить надежное соединение. Качество соединения проверяют, потянув за край пинцетом. После этого гидрофильную внутреннюю часть можно легко заполнить водным раствором, например, буферной средой или деионизированной водой.

Воду вводят в каждый исходный колодец и через соответствующую микропористую проточную ячейку. Как только все камеры будут заполнены, поверх всего устройства накладывают тонкий слой отвержденного PDMS, чтобы замедлить испарение и обеспечить стерильность. Для калибровки потока в устройстве, создаваемого давлением, предварительно заполняют микроструктурированные проточные ячейки деионизированной водой, а сверху на устройство устанавливают модуль потока, который служит интерфейсом подачи жидкости и стерильным уплотнением.

Этот модуль потока можно использовать самостоятельно или подключить к внешнему резервуару с жидкостью, например, к пластиковому шприцу. Подключите резервуар с жидкостью, такой как пластиковый шприц, или модуль потока к верхнему входу. Следите за тем, чтобы уровень жидкости в резервуаре оставался выше уровня выходного отверстия.

Разница в высоте между резервуаром на входе и каждым выходным отверстием определяет движущую силу потока под давлением, что позволяет количественно определить скорость потока через устройства. Для сбора образцов из выходных отверстий через регулярные интервалы времени используется игла 25-го калибра с тупым концом. Например, мы собираем образцы каждые 15–20 минут, тщательно фиксируя фактическое время, прошедшее между отборами.

Масса шприца регистрируется до и после отбора пробы на аналитических весах. Построят график зависимости общего объема от общего времени, где наклон линии будет равен средней скорости массового потока. Большое поперечное сечение входного резервуара по сравнению с выходными лунками помогает предотвратить значительные изменения скорости потока при перемещении жидкости через устройства; нанесите на график отобранный объем по оси Y и время отбора пробы по оси X.

Для определения наклона прямой в простой программе для построения графиков, такой как Excel, значение наклона используется для расчета среднего объемного расхода. Для визуализации потока и изучения поверхностных взаимодействий используется разбавленный раствор флуоресцентных латексных сфер концентрацией 3 µM с карбоксильными, YG и обычными YG поверхностями. Сначала в деионизированной воде готовят раствор сфер с концентрацией твердой фазы 0,01%.

Раствор добавляют в верхние лунки, после чего модуль потока снова присоединяют к zu. Поток микросфер визуализируют в течение одного часа и записывают примерно каждые 10 минут на флуоресцентном микроскопе Zeiss AIOt 25, оснащенном монохромной камерой MITx BCEB 0 1 3 U. Отдельные кадры захватывают в быстрой последовательности и объединяют в видеоролики с помощью такой программы, как Image J, используя флуоресцентное и проходящее освещение.

Видны как бусины, так и структуры. При блокировке проходящего света видны только ярко флуоресцирующие бусины. Стационарные бусины, осевшие на нижней поверхности или прикрепленные к коллекторам, отчетливо видны по всему устройству.

Для экспериментов с живыми бактериями, такими как виды Vibrio, подготавливают непатогенную бактерию, экспрессирующую зеленый флуоресцентный белок. Сначала из глубокой заморозки извлекаютt сток-культуру. В колбу со стерильной ростовой средой LB вносят сток-культуру.

С помощью одноразовой бактериологической петли содержимое колбы инкубируют в течение ночи при перемешивании до достижения стационарной фазы роста культуры с концентрацией примерно 10⁹ клеток на мл. В зависимости от целей исследования начальная концентрация бактерий может быть определена более точно. Подготавливают микрофлюидное устройство, заполненное стерильным буфером.

Затем стерильную жидкость из верхних лунок сливают и заменяют 20 µL бактериальной культуры. С помощью пипетки бактерии вводят в устройство, используя осторожное всасывание шприцем из выходных лунок. После инкубации количество бактерий в лунках можно определить путем количественного измерения интенсивности флуоресценции каждой лунки после колонизации. Верхнюю входную лунку снова опорожняют и заполняют буфером с концентрацией солей 25 ppt.

Искусственная морская вода подается под слабым давлением в верхние отверстия с помощью шприца, при этом отдельные проточные ячейки промываются от 20 до 40 µL буферного раствора. Это примерно в 100–200 раз превышает объем пор микрофлюидной почвенной части проточной ячейки после начальной промывки. Длительная перфузия бактерий через пористую среду осуществляется с использованием модуля потока точно так же, как было показано ранее.

Флуоресцентные изображения и изображения в белом свете, фиксирующие рост и транспорт бактерий, можно регистрировать в динамике. В данном эксперименте снимки делались каждые 15–20 часов в течение семи дней с использованием пятицветной камеры с охлаждаемой ПЗС-матрицей от Q imaging ink. Наши устройства также могут быть использованы для исследования влияния структуры физической среды обитания на обеспечение убежища для бактерий от хищничества простейших.

Здесь представлены бактерии в микропористой проточной кювете, в которой также видны гораздо более крупные реснитчатые простейшие eulo, питающиеся бактериями. При анализе потока жидкости в микрофлюидном устройстве установлено, что средняя скорость потока составляет 0.71 µL/min при напоре давления 40 mm. При увеличении напора давления до 60 mm скорость потока пропорционально увеличилась до 1.04 µL/min.

При использовании в устройстве гранул с различными вариантами модификации поверхности мы наблюдаем большее накопление некарбоксилированных гранул на поверхностях устройства. При этом гранулы диаметром от 6 до 10 мм с гораздо большей вероятностью оказывались зажатыми в отверстиях пор меньшего размера. Более высокая скорость потока, вызванная повышенным гидростатическим давлением, приводила к снижению удерживания и захвата гранул, что ожидаемо при анализе роста бактерий в микрофлюидном устройстве eco chipp.

Мы отмечаем качественные различия в интенсивности изображения в разных секторах устройства. Интенсивность флуоресценции может быть количественно определена в качестве косвенного показателя микробной биомассы в канале. В текущих экспериментах мы наблюдаем, что непрерывные сдвиговые силы в условиях низкого потока, по-видимому, вызывают агрегацию бактерий и образование хлопьев, что отчетливо видно на данных изображениях. Мы только что продемонстрировали вам, как создавать и использовать простые микрофлюидные устройства для измерения размера частиц, изучения транспорта частиц через пористые среды или исследования микробных взаимодействий в микроструктурированных средах обитания.

При проведении исследований с использованием проточных кюветов важно учитывать плавучесть частиц, а также поверхностную химию коллоидов и сорбентов. При переходе к микрофлюидному режиму поверхностные эффекты могут стать определяющими в наблюдаемых явлениях. Практически любую физическую структуру можно интегрировать в конструкцию микрофлюидного проточного модуля.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.