Многоцветный проточной цитометрии Анализ клеточного иммунного ответа на резус-макак
22 апреля 2010 г.
Мы демонстрируем полезность многоцветной проточной цитометрии для подробного фенотипические и функциональные характеристики от общего числа, а также памяти подмножеств CD4 + и CD8 + Т-клеток у макак-резус, идеальная модель для борьбы с ВИЧ / СПИД исследования вакцины.
В этом видео демонстрируется процедура стимуляции и окрашивания мононуклеарных клеток периферической крови или ПБМК. Для анализа многоцветной проточной цитометрии Алек Уоттс из pbmc, выделенный из цельной крови, помещают в планшеты для культивирования тканей. Клетки химически или биологически стимулируются для выработки иммунного ответа.
После стимуляции добавляется коктейль антител для идентификации типов клеток на основе экспрессированных поверхностных маркеров. Затем клетки проникают внутрь и добавляют другой коктейль антител для обнаружения экспрессии внутриклеточных цитокинов, затем клетки анализируют по фактам для определения цитокиновых профилей для конкретных подмножеств pbmc. Здравствуйте, меня зовут Эми Кортни из лаборатории доктора Джагана SAS на кафедре иммунологии Онкологического центра им. М. Б. Андерсона Техасского университета.
Привет, я тоже из лаборатории. Сегодня мы покажем вам мультицитометрический анализ Т-клеточных ответов. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения клеточных иммунных реакций в Reus Maca.
Итак, приступим. Начните этот протокол с использования гемоцитометра для определения жизнеспособного количества клеток pbmc из Reuss Maca методом исключения синего красителя Trian. Работа в ламинарном потоке колпака reus.
Суспензию клеток в полной среде в концентрации 10 миллионов клеток на миллилитр для неспецифической стимуляции по 100 микролитров клеточной суспензии вносят в каждую лунку 96-луночного тканевого планшета. Затем добавьте 100 микролитров среды, содержащей PMA и CIN, чтобы довести общий объем до 0,2 миллилитра с конечной концентрацией 50 нанограмм на миллилитр PMA и 500 нанограмм на миллилитр CIN для отрицательных контрольных лунок, добавьте по 100 микролитров только полной среды в каждую. Хорошо инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия во увлажненной атмосфере с 5% содержанием углекислого газа через 1,5 часа.
А фельден А вносят в культуру при конечной концентрации 10 мкг на миллилитр и инкубируют еще 4,5 часа. Фельден А добавляют к цитокинам трapp в аппарате Gold G для повышения видимости с помощью иммуноокрашивания, после стимуляции центрифуги для удаления среды, а затем промывают путем добавления 200 микролитров холодной промывки, буфера и центрифуги на низкой скорости. Повторите эту промывку, затем повторно отправьте 50 микролитров буфера для промывки.
Теперь клетки готовы к окрашиванию для экспрессии поверхностных маркеров в каждой лунке ресуспендированных клеток. Добавьте один микролитр живого мертвого фиксируемого флуоресцентного реактивного красителя, приготовленного в соответствии с инструкциями производителя и S. Инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия в темноте в течение 30 минут, пока клетки инкубируются.
Приготовьте растворы для окрашивания, которые будут использоваться для фактов в микропробирках. Во-первых, приготовьте стоячий коктейль, который будет включать в себя следующее. Титруемые флуоресцентно меченые моноклональные антитела, анти CD три PE SCI семь, анти CD восемь Alexa 700 анти CD 28 per CCP SCI 5.5, анти CD 95 A PC и анти CD четыре Pacific Blue Inflow Wash Buffer.
Затем подготовьте контроль компенсации, который будет использоваться для определения коэффициентов распространения каждого отдельного пятна в другие детекторы путем подготовки пробирки каждого флуоресцентно конъюгированного антитела по отдельности в виде одного цветного пятна. Наконец, приготовьте флуоресцентные красители минус один или FMO, объединив все реагенты, кроме интересующего. Это будет использоваться для определения границы между положительной и отрицательной популяцией путем дублирования уровней автофлуоресценции и данных, присутствующих в полностью окрашенных образцах.
После того, как клетки инкубировались в пятно от живого мертвеца, промойте их один раз с помощью промывочного буфера Cold Flow, чтобы удалить излишки красителя, аспирируйте буфер для стирки. Затем добавьте приготовленные растворы для окрашивания. Инкубируйте клетки при температуре четыре градуса Цельсия в темноте в течение 30 минут.
Промойте окрашенные клетки с помощью буфера для промывки холодным потоком, чтобы удалить излишки антител. Затем добавьте 100 микролитров проникающего раствора фиксации BD не менее чем на 10 минут. Храните клетки при температуре четыре градуса Цельсия в темноте до 24 часов до тех пор, пока они не будут использованы или продолжайте помечать внутриклеточные цитокины для маркировки внутриклеточных цитокинов.
Сначала проникните в клетки по 100 микролитров по одной Х химической завивке. Промойте буфер инкубируйте в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия в темноте, пока клетки инкубируются. Приготовьте окрашивающие антитела, компенсационные регуляторы и FMO-регуляторы в одном буфере для химической завивки, как и раньше.
После того, как клетки инкубируются в течение 10 минут, убавьте обороты и снимите один х буфер для промывки химической завивки. Добавьте соответствующие окрашивающие антитела. Затем инкубируйте клетки и антитела в течение 60 минут при температуре 4 градуса Цельсия в темноте после инкубации.
Промойте клетки два раза раствором для проникновения. После окончательной промывки восстановите суспендию клеток в 1%-ном параформном альдегиде в DPBS для фиксации клеток. Храните элементы при температуре четыре градуса Цельсия в темноте до тех пор, пока они не будут использоваться в течение 24 часов.
После того, как клетки были окрашены, используйте двухпоточный цитометр LSR или проточный цитометр DP для выполнения фактов. Затем проанализируйте данные с помощью FlowJo или аналогичного программного обеспечения. Состав PBMC в reuss Maca определяли с помощью факсимильного анализа.
На этом рисунке показана схема стробирования, используемая для анализа различных подмножеств Т-клеток от репрезентативного животного. Сначала лимфоциты были скобированы с помощью прямого рассеяния FSC против бокового рассеяния SSC, а затем были идентифицированы живые лимфоциты на основе SSC и AQUA-отрицательной популяции. Затем Т-клетки были идентифицированы с помощью CD 3 экспрессии, CD 4 положительных, CD 8 отрицательных и CD 4 отрицательных, CD 8 положительных популяций в пределах CD 3 положительных Т-клеток.
CD 4 положительные и CD 8 положительные Т-клетки были далее разделены на различные подмножества на основе экспрессии CD 28 и CD 95 в качестве наивных центральных клеток памяти и эффекторных клеток памяти. На этом рисунке показана продукция интерферона гамма и IL-2 в Unstimulated и pma. CIN стимулировал CD четыре положительные Т-клетки и субпопуляции.
Обратите внимание на отчетливые цитокиновые профили, вызванные стимуляцией. В каждом подмножестве. Мы должны показать вам, как провести многопоточный цитометрический анализ pbmc.
При выполнении этой процедуры важно помнить о настройке как одиночных элементов управления цветовой компенсацией, так и флуоресцентных элементов управления минус один. Оба эти контроля необходимы для правильного анализа данных проточной цитометрии. Пожалуйста, обратитесь к нашему письменному протоколу для получения дополнительной информации о выборе компенсационных регуляторов.
Кроме того, помните, что при использовании флуоресцентных меченых антител важно накрыть образцы для защиты от воздействия света. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном видео демонстрируется процедура стимуляции и окрашивания мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) для многоцветного анализа методом проточной цитометрии. Исследование сосредоточено на фенотипической и функциональной характеристике субпопуляций CD4+ и CD8+ T-клеток у макак-резусов, которые используются в качестве модели для исследования вакцин против ВИЧ/СПИДа.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Проточная цитометрия
- Исследования ВИЧ/СПИДа
Теоретические сведения
- Макаки-резус используются в качестве модели для изучения ВИЧ/СПИДа.
- Понимание подмножеств Т-клеток имеет решающее значение для разработки вакцин.
- Многоцветная проточная цитометрия позволяет проводить детальный анализ иммунных клеток.
- PBMC являются ключевыми компонентами при изучении иммунных ответов.
Цель исследования
- Для характеристики общего пула и подмножеств Т-клеток памяти.
- Для использования многоцветной проточной цитометрии с целью детального иммунного профилирования.
- Для углубления понимания иммунных ответов в контексте ВИЧ/СПИДа.
Используемые методы
- Выделение PBMC из цельной крови.
- Химическая или биологическая стимуляция PBMC.
- Использование коктейлей антител для идентификации типов клеток и поверхностных маркеров.
- Анализ профилей цитокинов с помощью проточной цитометрии.
Основные результаты
- Успешная стимуляция и окрашивание PBMC для последующего анализа.
- Идентификация специфических субпопуляций Т-клеток на основе поверхностных маркеров.
- Характеристика экспрессии внутриклеточных цитокинов.
- Получение данных об иммунных ответах, имеющих значение при ВИЧ/СПИДе.
Выводы
- Многоцветная проточная цитометрия эффективна для анализа Т-клеток.
- Макаки-резус предоставляют ценные данные для исследований вакцин против ВИЧ.
- Понимание динамики Т-клеток необходимо для разработки эффективных методов терапии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Многоцветная проточная цитометрия позволяет проводить точное фенотипическое и функциональное профилирование субпопуляций Т-клеток у макак-резусов, которые являются важнейшей доклинической моделью для разработки вакцин против ВИЧ. Данный подход способствует валидации мишеней путем количественной оценки иммунных ответов с продукцией цитокинов, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки на ранних этапах поиска. Метод повышает прогностическую достоверность, связывая антигенспецифическую стимуляцию с измеримым выходом внутриклеточных цитокинов в определенных популяциях клеток памяти.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем измерения продукции IFN-γ и IL-2 в субпопуляциях CD4+ и CD8+ T-клеток после стимуляции.
- Практическая ценность: Обеспечивает качественную и количественную оценку экспрессии внутриклеточных цитокинов для устранения неопределенности в механизмах при валидации иммунных мишеней.
- Научная ценность: Способствует снижению биологических рисков за счет высокочувствительного обнаружения малых фракций антигенспецифических T-клеток в образцах PBMC вакцинированных животных.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов анализа путем установления стандартизированных протоколов окрашивания и стимуляции для воспроизводимого иммунного профилирования.
- Практическая ценность: Решение вопросов стандартизации и воспроизводимости анализа за счет использования контролей компенсации и контролей FMO для обеспечения точного гейтирования популяций.
- Научная ценность: Подтверждение готовности к скринингу путем обеспечения возможности определения профилей цитокинов в наивных T-клетках, T-клетках центральной памяти и T-клетках эффекторной памяти.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обсуждается значимость для изучения заболевания путем сопоставления показателей внутриклеточных цитокинов у макак-резусов с патогенезом ВИЧ и иммунным ответом, индуцированным вакциной.
- Практическая ценность: Описывается преемственность процесса от этапа открытия до доклинической валидации путем установления связи между результатами стимуляции PBMC и функциональной характеристикой T-клеток.
- Научная ценность: Основное внимание уделяется прогностической оценке рисков путем использования продукции цитокинов в качестве функционального показателя для оценки иммуногенности вакцины.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод занимает определенное место в континууме исследований — от раннего иммунологического профилирования до идентификации перспективных соединений-лидеров, обеспечивая проверку гипотез и уточнение сигнальных путей в моделях инфекционных заболеваний.
- Фундаментальная биология: Объясняется, каким образом данный метод способствует проверке гипотез путем количественного определения продукции цитокинов в специфических субпопуляциях Т-клеток после стимуляции PMA/иономицином или антигенспецифической стимуляции.
- Скрининг: Описывается готовность анализа благодаря стандартизированной стимуляции, поверхностному и внутриклеточному окрашиванию, а также проточной цитометрической анализе образцов PBMC.
- Аналитика: Выделяются такие показатели, как частота продукции IFN-γ и IL-2, которые позволяют сравнивать иммунные ответы при различных условиях и в разных субпопуляциях.
- Трансляционные исследования: Метод обеспечивает преемственность доклинических исследований, связывая индуцированные вакциной Т-клеточные ответы у макаков-резусов с функциональным иммунным профилированием, имеющим значение для разработки вакцин против ВИЧ.
- Повторное использование в масштабах организации: Метод представлен как многократно используемый инструмент для лонгитюдного иммунного мониторинга различных кандидатов в вакцины и составов адъювантов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности, валидация мишеней, снижение механистической неопределенности в иммунных ответах, опосредованных T-клетками.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость многоцветных анализов проточной цитометрии для иммунного профилирования.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях программ разработки вакцин.
- Влияние на портфель: Приоритизация и решения о продвижении проектов с учетом рисков на основе количественных профилей цитокинов в доклинических моделях.
Особенности реализации
- Необходимый научный опыт в разработке панелей для проточной цитометрии, компенсации и стратегии гейтирования для многоцветного иммунофенотипирования.
- Потребности в инструментарии и аналитической инфраструктуре, включая проточный цитометр (например, LSR II) и программное обеспечение (например, FlowJo) для анализа многомерных данных.
- Требования к межкомандной стандартизации условий стимуляции, титрования антител и настройки контролей (одноцветных и FMO) между лабораториями.
- Вопросы адаптации для различных модельных систем, включая оптимизацию концентраций стимуляторов и времени инкубации для PBMC нечеловеческих приматов.
- Практические ограничения, подтвержденные исходными материалами: необходимость защиты флуоресцентных антител от света и тщательное титрование для минимизации перекрытия сигналов в многоцветных панелях.
