Важность правильной концентрации белка для кинетики и Affinity Определение в структурно-функционального анализа

Общая цель этой видеостатьи — дать ответы на следующие два вопроса. Во-первых, можно ли сделать исследования белковых взаимодействий более надежными, измеряя долю образца белка, которая действительно способна связываться с другим белком? Во-вторых, как кинетический анализ может дать нам лучшее понимание структуры и функциональных взаимосвязей?

Оба эти вопроса будут рассмотрены в эксперименте с участием Corp X 100, инструмента, который обнаруживает взаимодействия белков в режиме реального времени без использования меток. В этом эксперименте будет изучено взаимодействие бычьего цистатина B с цистиновой протеазой папаином, кристаллическая структура двух белков в комплексе указывает на несколько остатков, участвующих в связывании с протеазой, чтобы определить, как каждый из взаимодействующих остатков влияет на взаимодействие цистатина B с папином. Несколько вариантов цистатина B продуцируются посредством сайт-направленного мутагенеза.

В таких экспериментах всегда существует вероятность того, что рекомбинантные белки не будут сворачиваться правильно, агрегировать или разрушаться, что приведет к неправильным и невоспроизводимым результатам. VIACORE X 100 имеет возможность определять фракцию белка, доступную для связывания, путем калибровочного анализа свободной концентрации, сокращенно CFCA. Такой подход позволяет определить концентрацию белка с сохраненной связывающей активностью даже при отсутствии калибровочных стандартов.

CFCA будет использоваться здесь для определения концентрации вариантов цистатина B. Эти данные затем будут использоваться в качестве входных данных для определения кинетики связывания вариантов цистатина B с пепином, которая также оценивается с использованием BOR X 100. Здравствуйте, я CLA gram из GE Healthcare в Швеции.

Сегодня моя коллега Ева Пул покажет вам, как проводить анализ взаимосвязи структурных функций с использованием BOR X 100 Рекомбинантные белки могут демонстрировать неправильную активность сворачивания или рыхлой корзины с течением времени, и это поведение не может быть обнаружено методами, основанными на измерении общей концентрации. Это может привести к неправильным кинетическим данным после измерений концентрации с помощью калибровочного анализа свободной концентрации. Ядро B.A X 100 используется для анализа кинетики и аффинности взаимодействия вариантов цистатина B с пепаном.

Эти параметры дадут представление о механизме связывания. Мы начнем с краткого объяснения плана эксперимента, так что давайте начнем. Во взаимодействии между цистином, протеазой, папином и ингибитором цистатином В преобладают гидрофобные контакты, о чем свидетельствует кристаллическая структура двух белков в комплексе.

Со стороны ингибитора контактными зонами являются N и C концевые N и две шпильчатые петли. В этом исследовании рассматриваются четыре мутанта, каждый из которых содержит цистеин 3 к сирийской мутации, введенной для предотвращения димеризации цистатина B. Основываясь на контексте, выявленном в кристаллической структуре, лейцин 73 был мутирован в глицин гистамин 75 в глицин, а тирозин 97 был изменен на аланин. Две мутации глицина были введены для изучения важности боковых цепей гистидина 75 и лейцина 73 для связывания с Пепином, остаток тирозина был мутирован в аланин для исследования взаимодействия между С-концом цистатина В и Пепином.

Три двойных мутанта, а также три сирийских одиночных мутанта были протестированы на их взаимодействие с каталитически неактивным вариантом метилпопина папаина S. Эта каталитически неактивная форма протея имеет метильную группу, присоединенную к CYS 25 в активной щели. Для простоты мы будем называть этот вариант propan по всему протоколу.

CFCA основан на измерении скорости связывания в условиях, когда скорость ограничена диффузией молекул аналита на поверхность. Этому способствует высокий уровень иммобилизации лиганда. Перед началом процедуры иммобилизации поместите буфер HEP, используемый в экспериментах, на левый лоток и вставьте обе трубки.

Также поставьте пустую бутылку из-под мусора на правый поддон. Затем вставьте новый датчик гипсовой пятерки в прибор инициализируйте с помощью программного обеспечения core X 100, и на стартовом экране нажмите на пункт инструмента dock chip. Нажмите кнопку «Начать документ» в программе.

Затем используйте мастер иммобилизации для настройки папы и иммобилизации, нацелив соединение на CM 5 с начального экрана, нажмите на кнопку «Другие параметры», затем выберите мастера. Откроется окно с доступными мастерами. Выберите иммобилизацию и затем нажмите кнопку «Создать» В правом нижнем углу появится первый экран мастера иммобилизации, наведение сопряжения с датчиком гипса пять по умолчанию.

Установите флажок под второй проточной ячейкой, чтобы обездвижить ее во второй проточной ячейке. Проточная ячейка 1 остается неизмененной, чтобы использовать ее в качестве опорной поверхности из трех доступных вариантов ниже. Установите флажок Указать время контакта справа Целевой уровень изменяется на Время контакта, укажите время контакта 900 секунд.

Далее введите параметры иммобилизации в разделе Захват молекулы раствора слэш-лиганда. Войдите в папаин. Затем нажмите «Далее».

На следующем экране отображается схема расположения штатива для образцов. В первой позиции будет удерживаться этаноламин, используемый для дезактивации оставшегося активного вещества после нацеливания связывания лиганда папаина с поверхностью чипа. Введите раствор этаноламина, расположенный в первом положении, во втором положении.

Поместите лиганд папаин папаин в избыток метилсульфата и в дозе 50 мкг на миллилитр в 10 мкмольярном буфере из ацетата натрия. pH 4,5 восстановите реагенты для связывания EDC и NHS из набора для связывания аминов с помощью пипетки двойной дистиллированной воды 85 мкг EDC в флакон. Закройте его крышкой и установите в третью позицию.

Используйте тот же объем для NHS в четвертой позиции. Обратите внимание, что файл five должен быть закрыт и пуст, чтобы инструмент мог смешивать ED, C и NHS в этом файле. Также не забудьте заполнить пилку для промывки в положении H2O свежей деионизированной водой.

Когда штатив будет заполнен в соответствии с контуром на экране, нажмите кнопку Загрузить образцы и загрузите штатив в прибор. Когда стойка будет загружена, нажмите кнопку «Далее». Перед началом прогона отображается контрольный список.

Убедитесь, что все пункты выполнены тогда, когда они будут выполнены. Запуск запускается нажатием кнопки запуска. Запуск запускается во время процедуры иммобилизации.

Данные собираются в режиме реального времени. Сначала впрыскиваются связующие реагенты. Далее папе соединяется с поверхностью чипа, и процедура заканчивается деактивацией оставшихся активных эфиров.

После прогона появляется диалоговое окно, в котором подводятся итоги прогона. В этом окне отображается уровень иммобилизации. Вся процедура спаривания должна привести к обездвиживанию около 3000 RU папаина.

После того, как папаин был иммобилизован сенсорным чипом, начните анализ CFCA, разбавляя мутантные образцы цистатина B до общей концентрации около 10 наномоляров по меньшей мере в 300 микролитрах. Запишите коэффициент разбавления, так как мы будем использовать его позже в настройке анализа. Начните с вызова диалогового окна мастера, как описано в предыдущем разделе, в разделе концентрации папки с анализом.

Выберите бесплатную калибровку, затем выберите новую. На первом экране мастера отображается последовательность внедрения. Настройки могут остаться неизменными, так как здесь используется сенсорный чип CM five и подход прямого иммобилизационного анализа.

Нажмите «Далее» на следующем экране. Оставьте флажки активными перед запуском и установите флажки для запуска циклов запуска. Кроме того, оставьте по умолчанию количество циклов запуска неизменным — три.

Введите буфер кучи в имя поля решения. Затем нажмите «Далее». На следующем экране введите название регенерационного раствора, которое представляет собой 20 миллимолярный гидроксид натрия.

Остальные параметры оставьте без изменений. Нажмите кнопку «Далее», чтобы просмотреть образец таблицы. Настройте образцы в соответствии с таблицей образцов.

Каждая строка в таблице образцов приводит к двум циклам. Один с расходом 10 микролитров в минуту и один со скоростью 100 микролитров в минуту. Начните прогон с пустого места.

Затем введите название фактора разбавления, коэффициент диффузии при 20 градусах Цельсия и молекулярную массу. Для каждого мутанта коэффициент диффузии может быть рассчитан с помощью веб-инструмента на веб-сайте продукта. Ссылка на этот инструмент предоставлена в навигаторе поддержки программного обеспечения.

Так как рекомендуется запускать каждый образец и дублировать, скопируйте всю таблицу из пустой строки в последний образец и вставьте его в нижнюю часть таблицы. Нажмите «Далее», чтобы продолжить. На следующем экране отображается штатив для образцов.

Поместите образцы и реагенты в штатив в соответствии с схемой, указанной в программном обеспечении. Загрузите штатив в прибор, нажав кнопку загрузки образцов. Затем нажмите «Далее».

После загрузки образцов отображается экран напоминания с чек-листом. Обязательно все проверьте, а затем нажмите «Пуск». Данные собираются в режиме реального времени во время прогона.

Когда прогон будет завершен, закройте окно, в котором отображаются собранные данные. Обратите внимание, что в главном окне появился новый элемент результата. Для того, чтобы рассчитать концентрации по данным, выберите новый элемент результата и нажмите кнопку.

Оценка с помощью ядра X 100. Оценочное программное обеспечение запускается, отображая все собранные данные с панели инструментов, выбирает анализ концентрации, а затем освобождает калибровку из меню. В первом окне выберите данные, которые будут включены в анализ.

Прокрутите список и пошагово пройдитесь по списку просмотра, чтобы просмотреть данные для всех образцов. Если вы хотите исключить какие-либо данные, снимите галочку из списка. Нажмите «Далее», чтобы начать расчет.

Модель взаимодействия CFCA автоматически подгоняется к экспериментальным данным после завершения подгонки, результаты по каждому образцу отображаются в окне результатов. Пройдитесь по фитингам для каждого образца, выбрав соответствующую строку в таблице. Столбец, называемый измеренной концентрацией, показывает концентрацию в анализируемом образце.

Концентрация в исходном образце рассчитывается с использованием коэффициента разбавления, введенного ранее и показанного в столбце рассчитанная концентрация, когда закончите, нажмите «Готово», чтобы сохранить результат. Теперь, когда мы знаем концентрации белков из анализа CFCA, у нас есть отличная основа для наших последующих кинетических измерений. Кинетический анализ теперь поможет нам понять важность ключевых аминокислотных остатков для механизма связывания.

Давайте начнем с настройки кинетического анализа. Кинетический анализ начинается с стыковки нового сенсорного чипа CM 5 с прибором на стартовом экране. Выберите создание рабочего процесса анализа для сродства кинетики.

В левом верхнем углу появляется диалоговое окно, в которое вводится информация о лиганде. Введите название папаин в поле названия лиганда и выберите другой белок из списка видов. Затем выберите ковалентную иммобилизацию лиганда с помощью сенсорного чипа CM пять из двух представленных альтернативных подходов к присоединению лиганда, рекомендуемый рабочий процесс анализа теперь очерчен в правой части окна.

Он начинается с этапа иммобилизации, за которым следует этап анализа. Нажмите «Продолжить», чтобы продолжить. Сохраните рабочий процесс анализа в соответствии с запросом, введя имя и нажав кнопку «Сохранить».

Теперь программное обеспечение описывает рабочий процесс анализа с помощью кнопок, связанных с каждым этапом. Первым шагом в подготовке поверхности датчика является определение мобилизационного pH. Поскольку этот pH известен, нажмите Введите известное значение в появившемся диалоговом окне.

Введите название буфера ацетат и pH 4,5 и нажмите кнопку Сохранить. Рабочий процесс анализа теперь обновлен зеленой галочкой, указывающей на то, что этот шаг завершен. Теперь пришло время обездвижить, нажать кнопку бега на обездвиженном шаге.

Это приводит к тому же мастеру, который использовался для пропана и иммобилизации для анализа CFCA: иммобилизация папина для кинетического анализа настроена здесь таким же образом, за исключением того, что более разбавленный раствор вводится в течение меньшего времени. Это необходимо для того, чтобы обездвижить меньшее количество папина, чтобы избежать ситуаций, когда скорость связывания мутантов цистатина ограничена диффузией, так что кинетические данные могут быть измерены изолированно. Поскольку название лиганда и pH иммобилизации были введены на предыдущих этапах процесса анализа, они оба здесь предварительно установлены.

Единственное необходимое обновление — это 50 секунд для времени контакта. Затем иммобилизация протекает так, как показано ранее. Ожидаемый уровень связывания после иммобилизации составляет 50 R ru.

Зеленая галочка рядом с кнопкой запуска указывает на то, что иммобилизация завершена. Затем введите решение для регенерации в рабочий процесс на шаге. Найдите условия регенерации, нажав на ввод известных значений в появившемся диалоговом окне.

Введите решение по регенерации и время контакта. Затем нажмите «Сохранить». Теперь, когда лиганд обездвижен и введены условия регенерации, все готово для генерации кинетических данных в окне анализа Run kinetics Affinity, нажмите кнопку запуска на первом шаге кинетики.

Affinity wizard обрисовывает последовательность впрыска каждого цикла для кинетики одного цикла, которая здесь используется, нет необходимости что-либо менять. Нажмите «Далее», чтобы продолжить. На следующем шаге сохраните настройки по умолчанию, указывающие на подготовку системы перед запуском.

Выберите один цикл запуска, чтобы уравновесить поверхность чипа. Затем определите параметры впрыска для образца. Поскольку решение для регенерации было указано ранее, а настройка предопределена, нет необходимости изменять какие-либо параметры на экране.

Нажмите далее. Наконец, укажите примеры. Введите две строки для каждого мутантного варианта, одну пустую, а другую с образцом.

Холостой цикл обозначается установкой наивысшего параметра концентрации в ноль. Два. Варианты цистатина B могут быть установлены в каждом прогоне. Для каждого мутанта введите молекулярную массу, наивысшую концентрацию и коэффициент разведения, нажмите далее.

На следующем экране обрисована штатив для образцов. Приготовьте серию разведения образцов белка и поместите флаконы с крышками в штатив Как показано на экране, флакон с буфером помещают в положение 13, а флакон с регенерационным раствором — в положение 14. Обязательно наполните место для воды свежей водой.

Поместите штатив в машину и загрузите образцы, нажав кнопку загрузки образцов и нажав «Далее». Как и раньше, перед началом эксперимента выполните окончательную проверку, нажав кнопку Начать взаимодействие Данные отображаются в режиме реального времени. Когда прогон будет завершен, немедленно приступайте к запуску оставшихся вариантов цистатина B в соответствии с только что показанным на рисунке.

Если остальные варианты цистатина B запускаются последовательно, пропустите основной этап и цикл запуска, сняв соответствующие флажки в разделе step. Когда каждый запуск завершен, доступ к данным можно получить по ссылке. Все результаты в процессе анализа.

Появится диалоговое окно со всеми результатами, сгенерированными в рамках этого рабочего процесса. Чтобы рассчитать константы кинетической скорости, выберите результат для оценки и нажмите кнопку evaluate после того, как программное обеспечение для оценки ядра X 100 снова запустится с отображением всех совокупных данных. Выберите сродство кинетики в меню панели инструментов.

На первом скрининге для оценки выбирается цистеин от 3 до сирийского мутанта. Данные от этого мутанта отображаются вместе с пустым прогоном, выполненным для этого мутанта, продолжайте по клику. Следующий. На следующем экране отображаются данные с вычетом пустого прогона из прогона с образцом.

Выберите оценку кинетики, нажав кнопку кинетики. Теперь выберите подгонку данных под модель взаимодействия «один к одному». При нажатии на кнопку fit посадка отображается на экране в том виде, в котором она рассчитана.

Как только он будет готов, контроль качества будет автоматически применен и выделен внизу. Просмотрите элементы контроля качества, а затем посмотрите на данные датчика, чтобы убедиться, что граммы датчика показывают достаточную кривизну. Кроме того, взгляните на график остатков, показывающий различия между собранными данными и подогнанной моделью.

Обращайте внимание на систематические и неслучайные отклонения. Такая посадка приемлема. Теперь взгляните на кинетические данные во вкладке отчета.

Константа скорости ассоциации, константа скорости диссоциации и константа диссоциации равновесия. Когда закончите, нажмите «Готово» повторите ту же процедуру для всех остальных мутантов. Вот репрезентативные результаты анализа CFCA для различных исследованных вариантов цистатина B.

Данные о специфической концентрации связывания извлекаются из граммов датчика, полученных при расходе 10 и 100 микролитров в минуту. При сравнении концентрации, определенной с помощью измерения 2 80, с концентрацией, определенной CFCA, становится ясно, что, хотя в большинстве случаев белок полностью активен для варианта лейцина 73 глицина, доля активного белка очень низка. Кинетика связывания вариантов цистатина В с пепином определяется с помощью кинетики одного цикла.

Граммы датчика показывают пустые и эталонные вычитаемые данные с кинетической для модели взаимодействия «один к одному», наложенные черным цветом. Удельная концентрация связывания, измеренная с помощью CFCA для варианта лейцина 73, составляет всего около 10% от общей концентрации белка, определенной при измерении двух 80. При использовании правильной концентрации при расчете кинетических параметров становится ясно, что коэффициент ассоциации для Lucien 73 аналогичен таковому у других вариантов.

В то время как скорость ассоциации мутантов сопоставима с таковой у белка дикого типа, константа скорости диссоциации мутантов может быть выше почти на два порядка величины с соответствующим увеличением константы равновесной диссоциации. Сниженная аффинность зависит в основном от увеличения скорости диссоциации, что указывает на то, что как вторая петля связывания, так и С-концевой конец цистатина В вносят свой вклад в аффинность связывания, сохраняя ингибитор прикрепленным к ферменту после образования комплекса, использование анализа калибровочной свободной концентрации было существенным для этого вывода, поскольку один из мутантов оказался обладающим очень низкой связывающей активностью. Мой коллега Пол показал вам, как использовать bi core X 100 в исследовании структурированных функций. При проведении этих экспериментов важно помнить, что, хотя и концентрационный, и кинетический анализ основаны на одной и той же процедуре связывания, условия эксперимента совершенно разные.