Микрожидкостных Устройство для Количественная Бактериальные Хемотаксис в стабильных градиента концентрации

Штамм E Coli RP 4 37 вводят в устройство для изучения хемотаксиса, где бактерии подвергаются воздействию заданных пространственных градиентов концентрации. При попадании в камеру клетки оказываются в средней точке градиента концентрации. В зависимости от того, воспринимается ли сигнал как аттрактант или репеллент, бактерии быстро перемещаются либо вверх, либо вниз по градиенту концентрации.

Здравствуйте, я Дерек Энглер из Лаборатории молекулярной системной биотехнологии и кафедры химической инженерии Техасского университета A&M. Сегодня мы продемонстрируем процедуру исследования бактериального хемотаксиса в микрофлюидном устройстве. В наших лабораториях мы используем эту методику для изучения миграции E. coli RP437 в градиенте концентрации сульфата никеля.

Итак, приступим. Флюидный слой и управляющий слой изготавливаются методом репликационного формования полиметилсубоксана или PDMS с использованием мастер-формы из SU-8. Для начала этой процедуры смешайте преполимер PDMS и отвердитель в весовом соотношении 10:1.

Дегазируйте смесь в эксикаторе в течение одного часа до полного удаления пузырьков воздуха. Когда смесь PDMS будет готова, поместите мастер-форму SU eight в чашку Петри и осторожно залейте смесь поверх мастер-формы SU eight до достижения необходимой толщины. Нагревайте чашку Петри с PDMS и мастер-формой SU eight при 80 °C в течение двух часов для отверждения PDMS.

Через два часа снимите с нагревательной плитки отвержденный PDMS, покрывающий мастер-форму SU-8, и отделите форму из PDMS от мастер-формы SU-8. Желаемая структура будет встроена в форму из PDMS; с помощью тупоконечной иглы 20-го калибра проколите в форме из PDMS четыре отверстия для трубок, ведущих к генератору градиента, входу и выходу для клеток. Теперь мы готовы к сборке устройства из PDMS для его последующего склеивания.

Сначала очистите стеклянный предметное стекло изопропанолом и проверьте его с помощью Airstream. Затем подвергните форму из PDMS и предметное стекло воздействию кислородной плазмы в установке для плазменного травления в течение примерно 30 секунд. Прижмите форму из PDMS к предметному стеклу. Нагрейте соединенные стекло и форму из PDMS до 65 °C на нагревательном плите в течение 15 минут.

Для сборки устройства из PDMS используйте лезвие бритвы, чтобы отрезать трубку под углом 45 градусов до длины, необходимой в зависимости от конфигурации микроскопа. Затем с помощью пинцета вставьте один конец трубки в одно из четырех отверстий, проделанных в устройстве.

Вставьте тупоконечную иглу калибра 30G в другой конец трубки. Повторите установку трубок и наконечников игл для всех остальных отверстий. Наберите один миллилитр chemo taxes, буфера или CB в шприц объемом три миллилитра.

Осторожно удалите воздух из шприца. С помощью пипетки добавьте CB в основание выпускной иглы и постучите по нему, чтобы удалить пузырьки воздуха. Выдавите небольшое количество CB из кончика трехмиллилитрового шприца и подсоедините шприц к основанию иглы, не допуская попадания воздуха.

Прокачайте CB через устройство до тех пор, пока все оставшиеся части основания игл не будут заполнены CB. Это должно удалить большую часть пузырьков воздуха. Затем наполните два шприца объемом 500 µL CB, содержащим соответствующие концентрации тестируемого хемоэффектора.

Чтобы избежать образования пузырьков воздуха, выдавите небольшую каплю содержимого шприца, прикоснитесь этой каплей к жидкости в основании иглы и закрепите шприц для подготовки высокоподвижных бактерий. Для эксперимента по хемотаксису вырастите ночную культуру e coli RP 4 37 с плазмидой, экспрессирующей GFP, в триптон-бульоне или TB при 32 °C с перемешиванием. На следующий день используйте ночную культуру для инокуляции 20 мл среды TB в конической колбе Эрленмейера объемом 250 мл до достижения оптической плотности при 600 нм примерно 0,05.

Культивируйте клетки при 32 °C с перемешиванием до достижения OD 600 примерно от 0,35 до 0,45. Соберите клетки путем низкоскоростного центрифугирования и ресуспендируйте их в среде CB, содержащей хемоэффектор в концентрации, ожидаемой в центре канала, до достижения OD 600 около 0,35. Наконец, добавьте мертвые клетки, меченные RFP, с OD 600 около 0,35 к живым клеткам, экспрессирующим GFP.

Эти погибшие клетки будут служить внутренним контролем, чтобы убедиться, что любая миграция не вызвана эффектами потока. Теперь суспензия клеток готова к загрузке в микрофлюидное устройство для проведения эксперимента по хемотаксису. Чтобы начать эксперимент по хемотаксису, удалите часть CB из концентратора иглы впускного отверстия для клеток и заполните его суспензией клеток.

Осторожно наберите суспензию клеток в шприц объемом 50 µL. Делайте это медленно, так как жгутики могут быть повреждены, что приведет к снижению подвижности. Присоедините шприц объемом 50 µL к патрубку входной иглы, как было показано ранее: для этого выдавите небольшую каплю содержимого шприца, прикоснитесь каплей к жидкости в патрубке иглы и закрепите шприц. Поместите устройство на предметный столик флуоресцентного микроскопа, оснащенного высокоскоростной камерой для получения изображений.

Поместите оба входных шприца в шприцевой насос и запустите поток так, чтобы сформировался градиент и клетки начали перемещаться по трубкам. После того как клетки попадут в камеру хемотаксиса, подождите около 20 минут до стабилизации системы. Перед началом визуализации получите изображения флуоресценции живых (зеленых) и погибших (красных) клеток в различных точках по всей длине камеры.

Обычно мы собираем по 100 изображений в каждой точке с интервалом в три секунды. Полученные флуоресцентные изображения можно проанализировать с помощью любой коммерчески доступной программы для анализа изображений, такой как Image J или metamorph, либо используя простые коды, написанные в matlab. В данном примере мы будем использовать коды MATLAB.

Начните с удаления фоновых пикселей на изображении путем установки порогового значения интенсивности пикселей; удалите все пиксели, интенсивность которых ниже этого порога. Это позволит минимизировать шум. При анализе используйте положение погибших клеток для определения центра изображения.

Это положение соответствует точке входа клеток в камеру для хемотаксиса и месту их обнаружения при отсутствии миграции. Далее необходимо найти на изображении живые клетки, разделить изображение на каналы и определить количество живых клеток в каждом канале. В нашей предыдущей работе камера для хемотаксиса шириной 10 50 мкм была разделена на 64 канала шириной около 16 мкм каждый.

После повторения этих шагов для всех изображений просуммируйте общее количество клеток для каждого канала по всем изображениям. Таким образом будет получено общее число клеток, обнаруженных в каждом канале на протяжении всего эксперимента. Рассчитайте коэффициент хемотаксиса (коэффициент распределения или CPC), который характеризует направление миграции.

Выполнив следующие действия, присвойте множитель плюс один и минус один каждой клетке, расположенной в областях с высокой концентрацией (справа) и низкой концентрацией (слева) от погибших клеток соответственно. Суммируйте все полученные произведения и нормируйте результат по общему количеству обнаруженных клеток. Рассчитайте коэффициент хемотаксической миграции (CMC), который оценивает миграцию клеток в зависимости от пройденного расстояния.

Клетке, переместившейся в самую удаленную позицию с высокой концентрацией (канал 64), присваивается весовой коэффициент +1, в то время как клетке, переместившейся наполовину в сторону более высокой концентрации, присваивается весовой коэффициент +0,5. Перемещению в самую удаленную позицию с низкой концентрацией присваивается вес -1. Сумма всех взвешенных значений количества клеток нормируется по общему числу клеток для расчета CMC.

На данном графике показан линейный градиент или профиль концентрации, созданный в микрофлюидном устройстве с использованием флуоресцеин-изотиоцианата. Формирование градиента концентрации на этом рисунке продемонстрировано с помощью синего и желтого красителей. Вход для клеток был закрыт, чтобы исключить поток через него, и видно, что образуется диапазон цветов от синего до желтого.

Представлены псевдоцветные изображения типичного эксперимента по хемотаксису, в котором бактерии e coli RP 4 37 подвергались воздействию градиента L-аспартата от 0 до 100 µM или сульфата никеля от 0 до 225 µM внутри устройства. Миграция живых бактерий (зеленого цвета) по направлению к L-аспартату или в сторону от никеля регистрировалась каждые 2,5 секунды в течение 30 минут. Мертвые бактерии (красного цвета) служили контролем для оценки влияния потока в устройстве.

На данном графике показано пространственное распределение RP 4 37 в микрофлюидном устройстве в отсутствие градиента в сравнении с его ответом на градиент аспартата и градиент сульфата никеля. Мы только что продемонстрировали вам, как контролировать хемотаксис E. coli RP 4 37 в градиенте сульфата никеля. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости минимизировать вортексирование клеток, чтобы можно было использовать субпопуляцию с высокой подвижностью.

На этом все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.