Микрожидкостных Устройство для Количественная Бактериальные Хемотаксис в стабильных градиента концентрации

Кишечная палочка RP 4 37 вводится в хемотаксис-устройство, где они подвергаются воздействию определенной пространственной концентрации. Градиентные клетки, входящие в камеру, сталкиваются со средней точкой градиента концентрации. В зависимости от того, воспринимается ли сигнал как аттрактант или репеллент, бактерии быстро перемещаются либо вверх, либо вниз по градиенту концентрации.

Здравствуйте, я Дерек Энглер из Лаборатории биотехнологии молекулярных систем и факультета химической инженерии в Техасском университете. Сегодня мы покажем вам процедуру исследования бактериальной химиотерапии в микрофлюидном устройстве. Мы используем эту процедуру в наших лабораториях для изучения того, как кишечная палочка RP 4 37 мигрирует в градиенте концентрации сульфата никеля.

Итак, приступим. Флюидный слой и контрольный слой получают путем литья реплики полиметилсубоксана или PDMS из мастер-модели SU eight. Чтобы начать эту процедуру, смешайте предварительный полимер PDMS и сшиватель в соотношении 10 к одному весу.

Дегазируйте смесь в влагопоглотителе в течение одного часа, пока не будут удалены пузырьки воздуха. Когда смесь PDMS будет готова, поместите мастер SU eight в чашку Петри и аккуратно вылейте смесь сверху мастера SU eight до нужной густоты Heat. Чашка Петри, содержащая PDMS и SU eight, выдерживает температуру 80 градусов Цельсия в течение двух часов для отверждения PDMS.

Через два часа снимите с горячей плиты отвержденный мастер PDMS с покрытием SSU eight и снимите пресс-форму PDMS с мастера SU eight. Желаемая структура будет встроена в форму PDMS с помощью игольчатого отверстия 20 калибра с тупым концом, четыре отверстия в форме PDMS для прокладки трубок к градиентному генератору, входу и выходу ячейки. Теперь мы готовы к сборке устройства PDMS для соединения устройства PDMS.

Сначала очистите предметное стекло микроскопа изопропанолом и попробуйте использовать его с помощью Airstream. Затем подвергните форму PDMS и предметное стекло воздействию кислородной плазмы в станке плазменного травления в течение примерно 30 секунд. Соприблите форму PDMS со стеклянным предметным стеклом Нагрейте контактное предметное стекло и форму PDMS до 65 градусов Цельсия на горячей плите в течение 15 минут.

Чтобы собрать устройство PDMS, используйте лезвие бритвы, чтобы разрезать трубку под углом 45 градусов до нужной длины, необходимой в зависимости от конфигурации микроскопа. Затем с помощью щипцов. Вставьте один конец трубки в одно из четырех отверстий, пробитых в устройстве.

Вставьте тупую ступицу иглы 30 калибра в другой конец трубки. Повторите введение трубки и ступицы иглы для всех оставшихся отверстий. Загрузите один миллилитр химиотерапии, буфера или КБ в трехмиллилитровый шприц.

Осторожно удаляем воздух из шприца. Добавьте CB в ступицу выпускной иглы с помощью пипетки и постучите по ступице иглы, чтобы удалить пузырьки воздуха. Вытолкните немного CB из кончика трехмиллилитрового шприца и подсоедините шприц к ступице иглы, не задерживая воздух.

Проталкивайте CB через устройство, пока все оставшиеся ступицы игл не будут заполнены cb. Это должно удалить большую часть пузырьков воздуха. Затем наполните два шприца объемом 500 микролитров CB, содержащим соответствующие концентрации тестируемого химиоэффектора.

Устраните образование пузырьков воздуха, вытолкнув небольшую каплю содержимого шприца и прикоснувшись к каплям жидкости в ступице иглы и прикрепив шприц для приготовления высокоподвижных бактерий. Для эксперимента с хемотаксисом вырастите за ночь культуру кишечной палочки RP 4 37 с экспрессией GFP, плазмиду в триптонном бульоне или TB при 32 градусах Цельсия с встряхиванием на следующий день. Используйте ночную культуру для инокуляции 20-миллилитровой культуры туберкулеза в 250-миллилитровую колбу Эрленмейера с оптической плотностью на 600 нанометров около 0,05.

Выращивайте культуру при температуре 32 градуса Цельсия с встряхиванием, когда клетки находятся на наружном диаметре 600 примерно от 0,35 до 0,45. Соберите их с помощью низкоскоростного центрифугирования, ресуспензирующего клетки с наружным диаметром 600 около 0,35 в CB, содержащем химиоэффектор в концентрации, ожидаемой в середине канала. Наконец, добавьте меченные RFP мертвые клетки при отсутствии D 600 примерно 0,35 к GFP, экспрессирующему живые клетки.

Эти мертвые клетки будут использоваться для внутреннего контроля, чтобы гарантировать, что любая миграция не связана с эффектами потока. Теперь клеточная суспензия готова к загрузке в микрофлюидное устройство для эксперимента по хемотаксису. Чтобы начать эксперимент с хемотаксисом, удалите часть CB из впускного отверстия иглы клетки, и заполните ее клеточной суспензией.

Аккуратно наполните шприц объемом 50 микролитров ресуспендированными клетками. Делайте это медленно, так как жгутики могут быть срезаны, что снизит моторику. Прикрепите шприц емкостью 50 микролитров к впускной игле, как показано ранее, вытолкнув небольшую каплю содержимого шприца и коснувшись капли к жидкости в ступице иглы, а также прикрепив шприц, расположите устройство на предметном столике флуоресцентного микроскопа, оснащенного высокоскоростной камерой для получения изображений.

Поместите оба входных шприца в шприцевой насос и инициируйте поток таким образом, чтобы образовался градиент и клетки протекали через трубку. Как только клетки попадают в камеру химиотерапии, подождите около 20 минут, пока система стабилизируется. Перед получением изображений собирают живые зеленые и мертвые красные флуоресцентные изображения в разных местах по длине камеры.

Обычно мы собираем 100 изображений в каждой локации с интервалом в три секунды. Полученные флуоресцентные изображения могут быть проанализированы с помощью любой коммерчески доступной программы анализа изображений, такой как Image J или metamorph, или с помощью простых кодов, написанных в matlab. В этом примере мы будем использовать коды MATLAB.

Начните с удаления пикселей фона на изображении с помощью заданного порогового значения интенсивности пикселей и удалите все пиксели, интенсивность которых меньше порогового значения. Это сводит к минимуму шум. При анализе используйте положение мертвых клеток для определения центра изображения.

Это место, где клетки попали в камеру хемотаксиса и где они были бы обнаружены при отсутствии какой-либо миграции. Затем найдите живые клетки на изображении, разделите изображение на каналы и определите количество живых клеток в каждом канале. В нашей предыдущей работе камера химиотерапии шириной 10 50 микрометров была разделена на 64 канала, каждый из которых имел ширину около 16 микрометров.

После повторения этих действий для всех изображений часть общего числа ячеек подсчитывается для каждого канала на всех изображениях. Это дает общее количество клеток, обнаруженных в каждом канале в течение всего эксперимента. Рассчитайте налоги на химиотерапию, коэффициент распределения или CPC, который представляет направление миграции.

Выполнив следующие шаги, присвойте множитель плюс один и минус один каждой ячейке, расположенной в правой и низкой концентрации или левой сторонах мертвых ячеек соответственно. Сложите все умноженные значения и нормализуйте до общего количества обнаруженных ячеек. Рассчитайте химионалоги, коэффициент миграции, или CMC, который взвешивает миграцию клеток по пройденному расстоянию.

Ячейке, которая движется к самому дальнему каналу 64 с высокой концентрацией, присваивается весовой коэффициент плюс один, тогда как ячейке, которая движется на полпути к стороне с более высокой концентрацией, присваивается весовой коэффициент плюс 0,5 и ячейке. Переход в самую дальнюю позицию с низкой концентрацией имеет вес в минус единицу. Некоторые из всех взвешенных ячеек подсчитываются и нормализуются по количеству клеток для генерации CMC.

На этом графике показан линейный градиент концентрации или профиль, сформированный в микрофлюидном устройстве с использованием флуоресцеина изотиоцианата. Формирование градиента концентрации показано на этом рисунке с помощью красителей синего и желтого цвета. Входное отверстие ячейки было CA, так что через него не было потока, и можно видеть, что образуется диапазон цветов между синим и желтым.

Вот псевдоцветные изображения из репрезентативного эксперимента с хемотаксисом, в котором ecoli RP 4 37 подвергалась воздействию градиента от нуля до 100 микроляров L аспартата или от нуля до 225 микроляров сульфата никеля в устройстве. Миграция живых зеленых бактерий в сторону аспартата или от никеля визуализировалась каждые 2,5 секунды в течение 30 минут. Мертвые бактерии, показанные красным цветом, служили для контроля эффектов потока в устройстве.

Пространственное распределение RP 4 37 в микрофлюидном устройстве при отсутствии градиента показано на этом графике в сравнении с его реакцией на градиент аспартата и градиент сульфата никеля. Мы только что показали вам, как контролировать химиотерапию кишечной палочки RP 4 37 в градиенте сульфата никеля. При выполнении этой процедуры важно помнить о том, что необходимо свести к минимуму завихрение клеток, чтобы можно было использовать субпопуляцию с высокой подвижностью.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.