Изучение Synaptic Бассейны пузырьков использованием фотопревращения стириловых красителей

В этом видео показана процедура конвертации фотографий Styro Dye FM 1 43. Для изучения бассейнов синаптических везикул у drosophila melanogaster сначала рассекают личинки дрозофилы, чтобы обнажить вентральные мышцы, составляющие нервно-мышечное соединение или препарат NMJ. Препараты инкубируют в буфере, содержащем FM D, показанный здесь в клеточной мембране с серым мечением.

Затем они электрически или химически стимулируются, чтобы вызвать физическое слияние везикулной мембраны, интернализованной вслед. Стимулированный экзоцитоз окрашивают FM D. Затем внеклеточный краситель FM промывается, удаляя его из плазматической мембраны, и ткань фиксируется под непрерывным освещением высокой интенсивности. Краситель полностью обесцвечивается, а черный цвет появляется из-за диамино Бена и атмосферных осадков.

Затем этот осадок может быть визуализирован с помощью пропускания em. Здравствуйте, я Филипп о Пасо из лаборатории Сильвии Олли в Европейском институте неврологии в Гаоне, Германия. Сегодня мы покажем вам процедуру преобразования ЧМ фото в внутрипредсердный нервно-мышечный переход.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения синаптической пузырной рециркуляции. Итак, давайте начнем работать под микроскопом. Начните с того, что прикрепите личинки дрозофилы спинной стороной вверх в посуде с таким защитным покрытием.

Покройте его в физрастворе дрозофилы с помощью иглы шприца и найдите рассекающие ножницы на разрезе тыльной стороны в продольном направлении. Затем удаляют внутренние органы. Далее растягиваем заготовку и снова прикалываем ее к форме для сигар

Затем можно использовать несколько вентральных мышц для защиты FM-красителей, используемых в этой процедуре, от отбеливания. Эту процедуру следует выполнять в условиях недостаточной освещенности. Покройте защемленный дрозофилой препарат физиологическим раствором дрозофилы, содержащим 90 миллимоляров хлорида калия, и 10 микромоляров FM.1 43 для химической стимуляции нервов.

После стимуляции инкубируйте в течение одной минуты при комнатной температуре. Достаньте стимулирующий раствор и погрузите в блюдо с приколотой дрозофилой. Приготовление в стакане, наполненном 100 миллилитрами физиологического раствора дрозофилы два раза, для удаления внеклеточного FM 1 43 кубика, работающего под химическим защитным колпаком.

Зафиксируйте препарат нервно-мышечного перехода в 2,5% глутаральдегиде в фосфатно-солевом буфере или PBS в течение 45 минут при комнатной температуре. Промойте препарат один раз PBS, затем выньте его из формы для сигар и погрузите в 100 миллимолярный хлорид аммония на 15 минут. Для гашения свободных альдегидных групп оставшегося ягодичного фиксатора альдегида.

С помощью обычного PBS промойте раствор хлорида аммония, поместите препарат для нервно-мышечного перехода в новую сигарную посуду и погрузите его в фильтрованный 1,5 миллиграмм на миллилитр. Добавьте диамин бензин или DAB в PBS и инкубируйте в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Поместите образец под флуоресцентный микроскоп, оснащенный источником света ртутной лампой с корпусом лампы, содержащим заднее зеркало, используя сухой объектив с относительно малым увеличением.

Найдите образец. Затем с помощью обычного куба зеленого флуоресцентного фильтра для возбуждения синего цвета, сфокусируйте флуоресцентный сигнал. Нервно-мышечные соединения проявляются в виде ярких пятен на мышцах.

Далее, используя тот же набор флуоресцентных фильтров, подсвечивайте образец с максимальной интенсивностью до полного обесцвечивания FM D. При использовании объектива с 20-кратным увеличением должно быть достаточно от 30 до 45 минут. Однако время преобразования фотографий варьируется в зависимости от интенсивности освещения, силы проникновения DAB в препарат и используемого объектива.

После освещения осмотрите образец под просветлением. Если произошло преобразование фотографий, должен быть виден темно-коричневый осадок. Вернитесь к области вскрытия, затем с помощью ножниц вырезайте фото преобразованного пятна от личинки.

Вернитесь к области вскрытия. Затем с помощью ножниц вырезаем фото преобразованного пятна от личинок. Теперь поместите образец в микрофуге-пробирку, содержащую PBS, работающую под химическим защитным колпаком и одетую в соответствующее защитное оборудование, включая перчатки и средства защиты глаз.

Приготовьте 300 микролитров 1%-ного тетраоксида осмия на образец. Теперь поместите образец в стеклянную колбу с пластиковой крышкой и добавьте приготовленный раствор тетраоксида осмия для постфиксации препарата. Во время инкубации образца готовят отдельные растворы, содержащие 30, 50, 70, 90, 95 и 100% этанол.

Промойте образец четыре-пять раз PBS по пять минут каждый. После каждой промывки используйте пластиковый полиэтилен для переноса образца в пипетку, чтобы переложить образец в новую колбу. После последней промывки переложите образец в чистую стеклянную колбу.

Далее обезвоживайте образец, поместив его в ряд растворов этанола. Начните с инкубации в одном миллилитре 30%-ного этанола. Затем через пять минут удалите этанол с помощью пастбищной пипетки и замените его одним миллилитром 50% этанола.

Продолжайте обезвоживание, инкубируя препарат нервно-мышечного перехода в 70, 90, а затем 95% растворах. Затем образец инкубируют в растворе 95% этанола в большее количество раз, чем инкубировали в 100% этаноле три раза после обезвоживания. Добавьте к этанолу два миллилитра смолы EIN в соотношении один к одному и поместите образец на вращательную инкубацию.

От двух до четырех часов при комнатной температуре после вращения при 100% ein и поместите образец в открытую колбу, чтобы оставшийся этанол испарился в течение четырех-шести часов. Вылейте свежий EIN в форму. Добавьте препараты и выдерживайте при температуре 60 градусов Цельсия в течение 36 часов.

Когда заложенные EIN препараты будут готовы, используйте ультрамикротом для подготовки тонких срезов толщиной от 50 до 80 нанометров I с помощью алмазного ножа. Образцы разрезаются на тонкие срезы. Секции протекают на водяной бане ножа и впоследствии могут быть подняты на обычных электромагнитных решетках.

Теперь препараты готовы к визуализации с помощью традиционных процедур ЭМ. Изолированные нервно-мышечные соединения у Drosophila Melan gaster стимулировали с помощью высокого содержания калия и интернализованных мембран. Были окрашены с помощью FM 1 43, как показано здесь.

Флуоресценцию нервного окончания можно наблюдать с помощью обычного эпифлуоресцентного микроскопа. При непрерывном освещении краситель полностью обесцвечивается, а при продолжении освещения появляется черный цвет из-за осаждения динобензина. Это нервное окончание содержит синаптические везикулы, но ни один из них не преобразуется в фото.

Это может быть вызвано недостаточным освещением или плохим проникновением аминобензина DIA в ткани. Напротив, слишком большое освещение приводит к общему темному окончанию, где везикулы или органеллы не различимы, при соответствующей освещенности можно увидеть преобразование фотографий. На этой микрофотографии показан синаптический бутон, в котором видна лужа темных пузырьков, указывающих на преобразование FM-фотографий.

Мы только что показали вам, как сделать фотопреобразование синаптических везикул, помеченных fem die. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости всегда тщательно калибровать время подсветки для этапа преобразования. Вот и все.

Спасибо за просмотр. Удачи в ваших экспериментах.