Изучение Synaptic Бассейны пузырьков использованием фотопревращения стириловых красителей

В данном видео демонстрируется процедура фотоконверсии красителя Styro Dye FM 1 43. Для изучения пулов синаптических везикул у drosophila melanogaster сначала проводят диссекцию личинок дрозофилы для обнажения вентральных мышц, которые образуют препарат нервно-мышечного соединения (НМС). Препараты инкубируют в буфере, содержащем FM D, который показан здесь серым цветом и маркирует клеточную мембрану.

Затем их подвергают электрической или химической стимуляции для индукции физического слияния везикул; после этого происходит интернализация мембран. Стимулированный экзоцитоз окрашивают красителем FM D. Затем внеклеточный краситель FM вымывают, удаляя его с плазматической мембраны, и ткань фиксируют при непрерывном интенсивном освещении. Краситель полностью обесцвечивается, и появляется черный цвет за счет осаждения диаминобензидина.

Затем этот осадок можно визуализировать с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Здравствуйте, я Филипп О Пасо из лаборатории Сильвии Олли в Европейском институте нейронаук в Гёте, Германия. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру фотоконверсии FM в нервно-мышечном соединении.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения рециркуляции синаптических везикул. Итак, приступим. Работая под стереомикроскопом, закрепите личинку дрозофилы спинной стороной вверх в чашке, покрытой со guardar.

Покройте препарат физиологическим раствором для дрозофил с помощью иглы шприца, затем с помощью диссекционных ножниц сделайте продольный разрез по дорсальной стороне. После этого удалите внутренние органы. Затем растяните препарат и снова закрепите его булавками на чашке Петри.

Затем можно использовать несколько вентральных мышц для защиты красителей FM, применяемых в данной процедуре, от выцветания. Эту процедуру следует проводить в условиях низкой освещенности. Покройте зафиксированный препарат дрозофилы физиологическим раствором для дрозофил, содержащим 90 мM KCl и 10 µM FM1-43, для химической стимуляции нервов.

После стимуляции инкубируйте в течение одной минуты при комнатной температуре. Удалите стимулирующий раствор и, работая под вытяжным шкафом, дважды погрузите чашку с закрепленной дрозофилой в стакан, наполненный 100 миллилитрами физиологического раствора для дрозофил, чтобы удалить внеклеточный краситель FM 1-43.

Зафиксируйте препарат нервно-мышечного синапса в 2,5% растворе глутаральдегида в фосфатно-солевом буферном растворе или PBS в течение 45 минут при комнатной температуре. Один раз промойте препарат раствором PBS, затем извлеките его из чашки Петри и погрузите в 100 мМ раствор хлорида аммония на 15 минут, чтобы инактивировать свободные альдегидные группы оставшегося глутаральдегида.

Промойте раствор хлорида аммония обычным PBS, поместите препарат нервно-мышечного синапса в новую чашку для цигар и погрузите его в фильтрованный раствор диаминобензидина (DAB) в PBS с концентрацией 1.5 mg/mL; инкубируйте в течение 30 минут при температуре 4 °C. Разместите образец под флуоресцентным микроскопом, оснащенным ртутным источником света с корпусом лампы, содержащим заднее зеркало, используя сухой объектив с относительно низким увеличением.

Найдите образец. Затем, используя стандартный фильтр-куб с синим возбуждением и зеленым флуоресцентным фильтром, сфокусируйте флуоресцентный сигнал. Нервно-мышечные соединения будут видны в виде ярких точек на мышцах.

Затем, используя тот же набор флуоресцентных фильтров, освещайте образец с максимальной интенсивностью до полного выгорания FM D. При использовании объектива 20x должно быть достаточно от 30 до 45 минут. Однако время фотоконверсии варьируется в зависимости от интенсивности освещения, степени проникновения DAB в препарат и используемого объектива.

После облучения исследуйте образец при проходящем свете. Если произошло фотопревращение, должен быть виден темно-коричневый осадок. Вернитесь к диссекционному микроскопу, затем с помощью ножниц вырежьте из личинки участок, в котором произошло фотопревращение.

Вернитесь к диссекционному микроскопу. Затем с помощью ножниц вырежьте из личинки область, соответствующую участку на снимке. Теперь, работая в вытяжном шкафу и используя соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки и защитные очки, поместите образец в микроцентрифужную пробирку, содержащую PBS.

Приготовьте по 300 µL 1% раствора тетраоксида осмия на каждый образец. Поместите образец в стеклянный флакон с пластиковой крышкой и добавьте приготовленный раствор тетраоксида осмия для постфиксации препарата. Во время инкубации образца приготовьте отдельные растворы этанола с концентрацией 30, 50, 70, 90, 95 и 100%.

Промойте образец с PBS четыре-пять раз по пять минут каждый. После каждой промывки используйте пластиковый наконечник для пипетки, чтобы перенести образец в новую колбу. После последней промывки перенесите образец в чистую стеклянную колбу.

Затем обезвоживают образец, помещая его в серию растворов этанола. Начните с инкубации в одном миллилитре 30% ethanol. Затем через пять минут удалите этанол с помощью пипетки Пастера и замените его одним миллилитром 50% ethanol.

Продолжите обезвоживание, инкубируя препарат нервно-мышечного синапса в растворах 70%, 90% и затем 95%. После этого образец инкубируют в 95% растворе этанола несколько раз, а затем трижды в 100% этаноле после завершения обезвоживания. Добавьте два миллилитра смолы EIN в этаноле в соотношении один к одному и поместите образец в роторный инкубатор.

Выдерживайте от двух до четырех часов при комнатной температуре после центрифугирования при 100% ein, затем поместите образец в открытую колбу, чтобы остатки этанола испарились в течение четырех-шести часов. Налейте свежий EIN в форму. Добавьте препараты и инкубируйте при 60 °C в течение 36 часов.

Когда препараты, включенные в EIN, будут готовы, используйте ультрамикротом для приготовления срезов толщиной от 50 до 80 нанометров с помощью алмазного ножа. Образцы нарезают тонкими срезами. Срезы всплывают на поверхности водяной бани ножа, после чего их можно перенести на стандартные сетки для ЭМ.

Теперь препараты готовы к визуализации с использованием стандартных процедур электронной микроскопии. Изолированные нервно-мышечные соединения Drosophila melanogaster стимулировали с помощью высокого содержания калия, а интернализованные мембраны окрашивали красителем FM 1 43, как показано здесь.

Флуоресценцию нервного окончания можно наблюдать с помощью обычного эпифлуоресцентного микроскопа. При непрерывном освещении краситель полностью выцветает, и по мере продолжения освещения появляется черный цвет из-за осаждения динобензола. В этом нервном окончании содержатся синаптические пузырьки, однако ни один из них не подвергается фотоконверсии.

Это может быть вызвано недостаточным освещением или плохим проникновением диаминобензидина в ткань. Напротив, слишком интенсивное освещение приводит к общему затемнению терминала, при котором везикулы или органеллы становятся неразличимыми; при надлежащем же уровне освещения можно наблюдать фотоконверсию. На данной микрофотографии изображена синаптическая терминаль (бутон), в которой виден скоп темных везикул, что указывает на фотоконверсию FM.

Мы только что продемонстрировали вам способ фотоконверсии синаптических везикул, меченных красителем fem. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости всегда тщательно калибровать время освещения на этапе конверсии. На этом всё.

Спасибо за просмотр. Желаем успехов в ваших экспериментах.