Использование GELFREE 8100 Фракционирование Система Молекулярный вес основе фракционирования с жидким этапе восстановления

Здравствуйте, меня зовут Джей Харкинс. Я научный сотрудник компании Protein Discovery. Сегодня я продемонстрирую, насколько просто использовать новую систему фракционирования gel free 8, 100 для достижения высокого выхода при фракционировании белков по молекулярной массе.

С помощью системы GelFree можно вносить до одного миллиграмма общего белка на канал и воспроизводимо фракционировать до восьми образцов примерно за 90 минут. Система включает в себя прибор, одноразовый картридж и все необходимые буферы для проведения эксперимента. Итак, приступим.

Начните выполнение данной процедуры с подготовки и маркировки до восьми пробирок объемом 500 µL. Добавьте до 1 mg образца белка в объеме до 112 µL. Количество белка в образце зависит от сложности самого образца.

Для более сложных образцов, таких как гомогенат ткани, использованный в данной демонстрации, наилучшие результаты будут достигнуты при использовании от 150 до 200 µg на канал. Затем добавьте 30 µL пятикратного буфера для образцов, который входит в комплект картриджа для гель-электрофореза. В каждый образец белка добавьте 8 µL 1 M DTT.

Затем доведите объем каждого образца дистиллированной водой до конечного значения 150 µL. После этого прогрейте пробирки в течение пяти минут при 95 °C для денатурации образца. Дайте нагретым образцам остыть до комнатной температуры.

Извлеките картридж GelFree 8, 100 из фольгированного пакета. Снимите и утилизируйте герметизирующую пластину. С помощью пипетки удалите буфер для хранения из отсеков картриджа.

Если будут использоваться все восемь камер картриджа, переверните его, чтобы слить буфер для хранения из отделений. Затем в каждый резервуар с анодным буфером добавьте по 8 мл буфера для электрофореза. В каждый резервуар с катодным буфером добавьте по 6 мл, а в каждую камеру для сбора проб пипетируйте по 100 µL.

С помощью восьмиканального дозатора объемом от 100 до 200 µL удалите и утилизируйте весь буфер, который перетек из резервуара с катодным буфером в камеру загрузки образцов, и немедленно внесите образцы в загрузочные камеры. После загрузки образцов поместите картридж в станцию фракционирования GelFree 8, 100. Затем опустите электродные матрицы и закройте крышку; используя простой в программировании графический интерфейс пользователя на сенсорном дисплее прибора, перейдите к списку доступных предустановленных методов.

Выберите подходящий метод, нажав кнопку method. Нажмите кнопку retrieve и введите номер нужного предварительно запрограммированного метода. С помощью экранной клавиатуры нажмите okay. Затем нажмите кнопку apply.

Примененный метод отобразится в нижней части главного экрана. Каждый из предварительно запрограммированных методов состоит из набора значений напряжения и временных пауз, предназначенных для разделения белков в определенном диапазоне молекулярных масс. После выбора подходящего метода нажмите кнопку канала на главном экране.

Затем выберите каналы, которые будут использоваться при запуске. Чтобы выбрать все восемь каналов, нажмите «выбрать все». Затем нажмите «готово».

Чтобы вернуться на главный экран, убедитесь, что защитная крышка закрыта, а индикатор в нижней части экрана горит зеленым цветом. Теперь нажмите «start» для начала эксперимента; во время работы системы круги в окне в левой части экрана отображают статус каждого канала. Зеленый круг означает, что канал активен.

Прикладываемые напряжения и токи отображаются справа от кружков состояния каналов. Система gel free 8, 100 будет автоматически приостанавливать работу для сбора фракций через интервалы, указанные в методе. Когда работа прибора приостановлена для сбора фракций, появится текстовое окно с уведомлением о паузе, а кружки состояния станут желтыми.

Внутри картриджа между резервуарами анода и катода прикладывается постоянное напряжение. Под действием этого потенциала смесь белков электрофоретически перемещается из камеры для нанесения проб в специально разработанную прецизионную форму. Сначала белки концентрируются в виде узкой полосы в концентрирующем геле, после чего разделяются по своим молекулярным массам в разделяющем геле.

По мере элюции белков из геля они захватываются и концентрируются в жидкой фазе в камере сбора, свободной от геля. После этого работа прибора приостанавливается.

Фракции собирают с помощью пипетки через заранее определенные временные интервалы. Затем снова прикладывают потенциал, чтобы осуществить захват второй интересующей молекулярно-массовой фракции. Этот процесс повторяют до тех пор, пока не будут собраны все необходимые фракции.

Каждый картридж содержит восемь независимых электрофоретических каналов, что позволяет пользователю задействовать необходимое количество каналов, оставив неиспользованные для последующего применения. Для извлечения фракций откройте крышку прибора, затем воспользуйтесь встроенной дозатором для каналов. Перенесите 150 µL жидкости из каждой камеры сбора в пробирки или многолуночный планшет.

После извлечения фракций дважды промойте камеру сбора буфером для электрофореза без геля, добавив по 100 µL в каждый канал и дважды пропипетировав раствор. После промывки снова добавьте по 100 µL буфера для электрофореза без геля в камеры сбора. Закройте крышку и нажмите кнопку возобновления работы.

Система GelFree 8, 100 будет работать до следующего временного интервала. Общее оставшееся время эксперимента отображается в правой части экрана. Нажмите кнопку над полем с временем, чтобы переключаться между режимами отображения оставшегося времени, прошедшего времени и функцией паузы.

После сбора всех фракций их можно немедленно использовать для последующей подготовки, такой как изоэлектрическое фокусирование или гель-электрофорез, либо для анализа с помощью жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии или иммуноаффинного анализа. В данном демонстрационном эксперименте восемь образцов белка по 200 micrograms каждый были разделены на 12 фракций, что в сумме составило 96 фракций. Для визуализации результатов фракционирования аликвота каждой из 12 фракций образца гомогената печени быка была нанесена на стандартный одномерный гель с последующим окрашиванием серебром.

Как показано на данном рисунке, образец белка был разделен на 12 отдельных фракций, охватывающих диапазон молекулярных масс от 3.5 килДальтон до 150 килДальтон. Представленный здесь гель демонстрирует способность системы gel free 8, 100 фракционировать большое количество белка на отдельные фракции по молекулярной массе. Это невероятно мощный инструмент для top-down и bottom-up протеомики с использованием масс-спектрометрии, а также для экспериментов по иммуноаффинной очистке, где требуется одна очищенная фракция интактного белка определенной молекулярной массы.

Мы были рады продемонстрировать вам, насколько легко использовать систему фракционирования gel free 8, 100 для воспроизводимого разделения вашего образца на отдельные фракции по молекулярной массе и достижения высокого уровня восстановления жидкой фазы. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.