Использование GELFREE 8100 Фракционирование Система Молекулярный вес основе фракционирования с жидким этапе восстановления

Здравствуйте, меня зовут Джей Харкинс. Я научный сотрудник в Protein Discovery. Сегодня я продемонстрирую, насколько легко использовать новую систему фракционирования 8, 100 без геля для достижения фракционирования на основе молекулярной массы с высоким уровнем восстановления.

Используя гелеобразный раствор, вы можете загрузить до одного миллиграмма общего белка на канал и воспроизводимо фракционировать до восьми образцов примерно за 90 минут. Итак, система включает в себя прибор, одноразовый картридж и все буферы, необходимые для проведения эксперимента. Итак, приступим.

Начните эту процедуру с установки и маркировки до восьми пробирок по 500 микролитров на каждую пробирку. Добавьте до одного миллиграмм образца белка в объеме до 112 микролитров. Количество белка в образце зависит от сложности образца.

Для более сложных образцов, таких как гомогенат ткани, используемый для этой демонстрации, от 150 до 200 микрограммов на канал дадут наилучшие результаты. Далее добавьте 30 микролитров пяти х буфера для проб, который входит в комплект картриджей без геля. К каждому образцу белка добавьте восемь микролитров одного моляра DTT.

Затем отрегулируйте каждый образец с водой до конечного объема 150 микролитров. Затем нагрейте флаконы в течение пяти минут при температуре 95 градусов Цельсия, чтобы денатурировать образец. Дайте нагретым образцам остыть до комнатной температуры, пока образец остывает.

Извлеките картридж без геля 8, 100 из пакета из фольги. Снимите и выбросьте герметик для пластин. Извлеките буфер для хранения из отсеков для картриджей с помощью пипетки.

Если будут использоваться все восемь камер картриджа, переверните картридж, чтобы слить буфер хранения из отсеков. Далее в каждый из анодных буферных резервуаров добавляется восемь миллилитров геля для свободного хода. В каждый из буферных резервуаров катода добавляется по шесть миллилитров, а в каждую из камер сбора впрыскивается по 100 микролитров.

С помощью восьмиканального пипеттера объемом от 100 до 200 микролитров удалите и отбросьте любой буфер, который вытек из резервуара с катодным буфером в камеру загрузки проб, и немедленно загрузите образцы в камеры загрузки. После загрузки образцов поместите картридж в станцию фракционирования без геля 8, 100. Затем опустите электродные решетки и закройте крышку с помощью простого в программировании графического интерфейса пользователя на сенсорном дисплее прибора, перейдите к списку доступных предварительно запрограммированных методов.

Выберите подходящий способ, нажав кнопку метода. Нажмите кнопку извлечения и введите номер нужного предварительно запрограммированного метода С помощью экранной клавиатуры нажмите OK. Затем нажмите кнопку «Применить».

Примененный метод появится в нижней части главного экрана. Каждый из предварительно запрограммированных методов состоит из заданных напряжений и временных пауз, предназначенных для разрешения белков в определенном диапазоне молекулярных масс. После того, как подходящий метод будет выбран, нажмите кнопку канала на главном экране.

Затем выберите каналы, которые будут использоваться в прогоне. Чтобы выбрать все восемь каналов, нажмите кнопку «Выбрать все». Затем нажмите «Готово».

Чтобы вернуться к основному экрану, убедитесь, что защитная крышка закрыта, а индикатор горит зеленым цветом в нижней части экрана. Теперь нажмите «Старт», чтобы начать эксперимент во время работы системы, круги, показанные в поле в левой части экрана, отображают состояние каждого канала. Зеленый кружок указывает на то, что канал активен.

Приложенные напряжения и токи отображаются справа от кругов состояния канала. Gel free 8, 100 автоматически приостановит сбор фракции с интервалом, указанным в методе. Когда инструмент будет поставлен на паузу для сбора дробей, появится текстовое поле, уведомляющее вас о том, что произошла пауза, а круги состояния станут желтыми.

Внутри картриджа между анодным и катодным резервуарами подается постоянное напряжение. Под действием этого потенциала белковая смесь электрофоретически приводится в движение из загрузочной камеры в специально разработанную прецизионную отливку. Гелевые белки сначала укладываются внутри острой полосы в укладывающемся геле, а затем разрешаются на основе их соответствующих молекулярных масс в разрешающем геле.

Когда белки вымываются из геля, они захватываются и концентрируются в жидкой фазе. В коллекции камеры геле нет. Затем прибор ставится на паузу.

На основе заранее выбранных временных интервалов и фракции собираются с помощью пипетки. Затем потенциал снова прикладывают для того, чтобы в конечном итоге захватить вторую интересующую молекулярную массовую фракцию. Затем этот процесс повторяется до тех пор, пока не будут собраны все желаемые фракции.

Каждый картридж содержит восемь независимых электрофоретических каналов, поэтому пользователь может запустить столько каналов, сколько ему нужно, и сохранить неиспользуемые каналы для использования в будущем. Чтобы удалить фракции, откройте крышку прибора, после чего воспользуйтесь пипеткой с внутренним каналом. Перелейте 150 микролитров жидкости из каждой из камер сбора в сборные пробирки или многолуночный планшет.

После удаления фракций дважды промойте камеру сбора гелевым буфером со свободным ходом, добавив 100 микролитров на канал и дважды пипетируя вверх и вниз. После промывки добавьте 100 микролитров геля в буфер для свободного течения обратно в камеры сбора. Закройте крышку и нажмите кнопку возобновления.

Гелевый free 8, 100 будет работать до следующего временного интервала. Общее время, оставшееся до окончания эксперимента, отображается в правой части экрана. Нажмите кнопку над полем отображения времени, чтобы переключиться между оставшимся временем и временем паузы.

После того, как все фракции собраны, их можно сразу же использовать для дальнейшей подготовки, такой как изоэлектрическая фокусировка или гель-электрофорез, или для анализа с помощью жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии или иммуноаффинности. В этой демонстрации восемь образцов белка по 200 микрограммов каждый были разделены на 12 фракций каждая, что в общей сложности составило 96 фракций. Чтобы визуализировать результаты фракционирования и аликвоты каждой из 12 фракций из бычьей печени, образец гомогената был затем запущен на стандартном 1D-геле и окрашен серебром.

Как показано на этом рисунке, образец белка был фракционирован на 12 различных фракций, охватывающих диапазон молекулярной массы от 3,5 килодальтон до 150 килодальтон. Показанный здесь гель подчеркивает способность безгелевой системы 8, 100 фракционировать большое количество белка на различные молекулярно-массовые фракции. Это невероятно мощный инструмент для нисходящей и восходящей протеомики с использованием масс-спектрометрии, а также экспериментов по иммуноаффинности, где требуется одна очищенная фракция молекулярной массы неповрежденного белка.

Было приятно показать вам, как легко использовать систему фракционирования 8, 100 без геля для воспроизводимого разделения образца на дискретные фракции молекулярной массы и достижения высокого восстановления жидкой фазы. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.