Молочные Эпителиальные Процедура трансплантации

В данном видео демонстрируются процедуры по выделению эпителия молочной железы, очистке жировой подушки молочной железы и трансплантации экзогенного эпителия для изучения развития молочной железы у трехнедельных мышей; рост эпителиального дерева молочной железы ограничен областью вокруг соска, а жировая подушка в значительной степени лишена эпителия молочной железы. По мере созревания мыши эпителиальное дерево разрастается через жировую подушку.

К семи неделям эпителиальное разветвление протоков распространяется по всей жировой подушке. Если на третьей неделе жизни удалить небольшую часть жировой подушки, содержащую эпителий, эндогенный эпителий никогда не заселит эту «память» жировой подушки; такая подушка описывается как очищенная и остается таковой при достижении зрелости. Однако трансплантированная донорская «память», эпителий или эпителиальные клетки обладают способностью формировать разветвленные протоки по всей очищенной жировой подушке реципиента.

Жировая подушка. Затем с помощью гистологии можно контролировать прогрессирование развития памяти в трансплантированных тканях трансгенных или подопытных животных. Здравствуйте, меня зовут Джозеф Джерри, я сотрудник кафедры ветеринарных и анималистических наук Массачусетского университета.

Здравствуйте, меня зовут Карен Данфи. Я работаю в лаборатории Джерри. Сегодня мы проведем трансплантацию эпителия молочной железы.

Мы используем эту процедуру для изучения молекулярных и клеточных основ генеза опухолей молочной железы на модели рака груди. Итак, приступим. Первым этапом процедуры трансплантации является забор эпителиальной ткани молочной железы у мыши-донора.

Начните с промывания недавно эвтаназированной мыши женского пола 70% ethanol, стараясь не повредить мембраны SRU в брюшной полости. Сделайте срединный сагиттальный разрез кожи от лобковой кости до грудины. Затем сделайте косые разрезы от начального разреза в области лобковой кости в направлении каждой задней конечности.

С помощью изогнутого пинцета захватите мембраны SRU. Затем, используя прямой зубчатый пинцет, захватите срез кожи и осторожно отделите стенку тела от мембран S cs.

Для обнажения четвертой паховой памяти-железы, прикрепленной к нижней стороне стенки тела, необходимо найти лимфатический узел внутри железы: он расположен на пересечении трех крупных кровеносных сосудов и прощупывается как плотный узелок внутри жировой подушки. Кончиком глазных ножниц аккуратно надрежьте жировую ткань вокруг лимфатического узла. Затем, прижав указательным пальцем кожу со стороны эпидермиса, надавите, чтобы приподнять узел над жировой подушкой, и зажмите его для отделения.

С помощью изогнутого пинцета удалите лимфатический узел. Удерживая края кожи, захватите жировую подушку за края изогнутым пинцетом и постепенно отделите её от брюшной стенки. Двигаясь в направлении жировой подушки к дорсальной поверхности мыши, удалите всю молочную железу целиком.

Поместите железу памяти на стерильный пластиковый разделочный блок и добавьте небольшое количество среды, примерно 200 µL, на поверхность железы, чтобы она оставалась увлажненной. Затем измельчите железу на кусочки размером 1 мм с помощью нового лезвия бритвы. Разделите измельченную железу на четыре порции.

Затем с помощью пинцета распределите образец по четырем криопробиркам со средой для замораживания. Поместите криопробирки в контейнер для заморозки клеток Nalgene, в который в बाहरी отсек налито 250 milliliters изопропилового спирта. Затем поместите контейнер для заморозки клеток при температуре minus 70 degrees Celsius на 24 hours.

Через 24 часа перенесите замороженные пробирки с фрагментами памяти в жидкий азот до момента их использования для трансплантации. Каждая криопробирка содержит достаточное количество фрагментов памяти для трансплантации в очищенные жировые подушки четырех-восьми мышей-реципиентов. После проверки глубины анестезии трехнедельной мыши-реципиента с помощью щипка за пальцем плотно зафиксируйте мышь на хирургическом столе брюшной стороной вверх с вытянутыми конечностями так, чтобы живот был натянут.

Необходимо ввести предоперационный анальгетик, бупивакаин или бупренорфин, подкожно. С помощью пинцета продезинфицируйте область хирургического вмешательства спиртом и скрабом на основе йода. Захватите кожу в нескольких миллиметрах над тазом и приподнимите ее над брюшной полостью.

Осторожно надрежьте кожу, следя за тем, чтобы первый разрез не проходил слишком близко к уретре, так как установка зажимов для ран может затруднить мочеиспускание мыши. Затем, стараясь не проколоть мембраны SRU, сделайте срединный сагиттальный разрез кожи от лобковой кости до грудины.

Теперь от места первоначального разреза сделайте косые надрезы кожи от срединной линии через таз в направлении каждой задней конечности. С помощью изогнутого пинцета осторожно захватите серозные оболочки вентральной стенки тела. Затем с помощью анатомического пинцета захватите разрезный край кожи и оттяните стенку тела от серозных оболочек.

Для обнажения четвертой паховой железы памяти идентифицируйте четвертую железу памяти. Найдите пятую железу памяти, прижгите соскоковый узел и две артерии, ведущие к этому узлу. Разделите четвертую и пятую железы, затем прижгите край пятой железы.

Затем с помощью ножниц сделайте разрез поперек жировой подушки вентральнее узла, чтобы отделить жировую подушку четвертой памяти железы. Используя изогнутый пинцет, крепко захватите вентральную часть жировой подушки и оттяните ее от брюшной стенки. Рекомендуется зажать иссеченную ткань целиком между двумя маркированными предметными стеклами и зафиксировать в фиксаторе Карнуэ.

Впоследствии ткань можно окрасить, зафиксировать на предметном стекле и оценить чистоту краев среза. С помощью пинцета удалите все остатки памятинной железы вокруг области удаленной части жировой подушки. Теперь животное готово к трансплантации ткани или клеток.

Свежую или подвергнутую экспресс-заморозке донорскую эпителиальную ткань можно трансплантировать в очищенную жировую подушку. В качестве альтернативы могут быть трансплантированы иммортализованные клеточные линии эпителия, клеточные линии опухолей или первичные клетки. Подробную информацию по подготовке клеток см. в прилагаемом письменном протоколе по трансплантации фрагментов эпителия.Подготовлено.

Видео начинается с размораживания криопробирки с эпителием и переноса фрагментов в чашку Петри со свежей средой. Чтобы вымыть DMSO, с помощью ножниц сделайте карман в очищенном эпителии жировой подушки реципиентной мыши. Затем, используя игольчатый пинцет, поместите фрагмент донорского эпителия размером 1 мм в этот карман.

При необходимости зажмите края кармана тканевым пинцетом и извлеките игольцедержатель, чтобы ткани оставались на месте. Захватите противоположные края кожи. Удерживайте их вместе с помощью пинцета.

Приподнимите их над серозными оболочками брюшной полости и закройте раны с помощью хирургических зажимов. Используйте два зажима для закрытия срединного сагиттального разреза и по одному зажиму для каждого косого разреза. При необходимости избегайте пережатия уретры.

Ушейте швы на коже в месте пересечения срединного сагиттального и косого разрезов. Поместите мышь в клетку и держите её под греющей лампой до полного пробуждения животного. Зажимы для ран следует удалить через две недели.

На следующих слайдах представлены репрезентативные изображения того, что можно ожидать увидеть в памяти желез хозяина после очистки накормленной подушечки и трансплантации эпителия; на данном изображении показан эндогенный эпителий памяти, удаленный у трехнедельной мыши. В процедуре очистки железы обратите внимание на четкие границы по краю разреза. После каждой процедуры следует готовить подобный целостный препарат для оценки чистоты границ.

На этом изображении показана просветленная жировая подушка мыши через семь недель после процедуры просветления. Обратите внимание, что вся жировая подушка лишена памяти, эпителия, гематина и ацинусов. Окрашивание просветленной жировой подушки через семь недель после процедуры просветления также демонстрирует, что железа лишена памяти эпителия.

Представлен репрезентативный целый препарат осветленной жировой подушки с трансплантированным донорским эпителием памяти от 10-недельной мыши. Обратите внимание, что трансплантированный эпителий сформировал нормальные эпителиальные протоковые деревья, гематин и ацинусы. Окрашивание осветленной жировой подушки и эпителия памяти.

Трансплантация эпителия в том же возрасте демонстрирует нормальное формирование эпителиальных протоков из экзогенного эпителия. Здесь, при окрашивании гематилином и эозином просветленной жировой подушки, виден эпителиальный трансплантат, который развился в опухоль молочной железы. Мы только что показали вам, как выделить эпителий молочной железы и выполнить трансплантацию эпителия молочной железы.

При выполнении данной процедуры важно не забыть перерезать связи между четвертой и пятой долями железы, чтобы прижечь узел и сосок, а также удалить все следы эндогенного эпителия. Необходимо убедиться в отсутствии возможности прорастания эндогенного эпителия в очищенную жировую подушку. Кроме того, рекомендуется сохранить весь объем удаленной части молочной железы для проверки чистоты краев резекции.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.