Восстановление мыши ооцитов

Меня зовут Аманда Дли. Я работаю в лаборатории доктора Пола Вераны в Калифорнийском университете в Ирвайне. Сегодня я продемонстрирую вам процедуру забора ооцитов.

Это предполагает выделение яйцеводов у самки. После выделения яйцеводов через них вводится среда FHM, в результате чего циты должны выйти из матки. После этого мы изолируем циты в среде и будем использовать их для последующих экспериментов.

Помимо выделения цитов, данную процедуру можно использовать для выделения эмбрионов на определенных этапах развития. Одной из причин, по которой полезно ознакомиться с этой процедурой в видеоформате, является то, что различные отделы яйцевода бывает очень трудно распознать. В этом видео я укажу на воронку (infundibulum), куда следует вводить среду FHM.

Для проведения диссекции вам понадобятся два набора острых пинцетов и одни острые ножницы. Яйцеводы, извлеченные у самки, помещают в среду FHM, находящуюся в чашке для культивирования тканей диаметром 35 мм. Яйца извлекают с помощью иглы с тупым концом диаметром 30 мм, прикрепленной к шприцу объемом 1 мл, при этом яйцевод стабилизируют острым пинцетом.

FHM — это поддерживающая среда, используемая для сбора цитов. KSOM — среда, используемая для культивирования цитов в инкубаторе в случае их оплодотворения. После извлечения яйцеклеток и эмбрионов из яйцевода мы будем использовать стеклянную переносящую пипетку, вытянутую из капиллярной трубки; к ней присоединяют трубку и с помощью ротовой пипетки переносят их в поддерживающую среду.

Для удерживания эмбрионов и икринок используется стеклянная чашка с лунками. Их можно помещать в каждую отдельную лунку, чтобы они находились в обособленных местах, что облегчает их поиск. Эта чашка помещается в данный контейнер, что позволяет поместить её в CO2-инкубатор без использования масла.

В зависимости от используемой среды, поверх среды FHM или KSOM в основание наливают воду, закрывают кран, чтобы жидкость оставалась на месте. Для предотвращения попадания волосков используют 70% ethanol. Затем делают небольшой разрез в области живота и разрез брюшной полости.

Мы расширим разрез, чтобы открыть брюшную полость. После того как будет обеспечен доступ к матке, мы отодвинем кишечник в сторону, и тогда матка окажется видна ниже. Матка имеет Y-образную форму, и мы осторожно возьмем часть матки.

После разреза яйцевод выглядит как спагетти. Я постараюсь взять часть яйцевода. Я возьму яйцевод и часть яичников, которые окружены жировой тканью.

Теперь будет взята другая сторона. На данном этапе мы снова захватим яичник или матку. Захватываем матку здесь, делаем разрез ниже точки прикрепления. На этом этапе обнаруживаются яйцеводы.

Я возьму часть правого яичника с нами. Затем ее поместят в среду. Матка все еще сокращается.

Матка состоит из гладких мышц, поэтому, даже будучи отделенной от организма, нейроны в ней продолжают посылать импульсы. Здесь представлена матка. Хотя яйцевод выглядит как спагетти и находится под яичником, на самом деле яйцевод не прикреплен к яичнику.

Хотя на данном этапе мы видим лишь часть яичника, в моей правой руке (ведущей) я держу тупоконечную иглу 30-го калибра. Я использую ее в качестве пинцета, чтобы изолировать внутреннюю бедренную кость. После того как она будет изолирована, я введу тупоконечную иглу во внутреннюю бедренную кость и впрысну жидкость, которая затем вытечет из матки.

В левой руке я держу острый пинцет. Он используется для изоляции малоберцовой кости и фиксации всех структур. Здесь изолирована амдула, имеющая форму трубы.

Кончик моей иглы находится в области малоберцовой кости, она проходит сквозь слой ткани. Хорошо. Чтобы убедиться, что я изолировал все эмбрионы и яйцеклетки, я аккуратно сжимаю матку, подобно тюбику с зубной пастой. Сосредоточившись на жировых подушках, нужно найти образования, похожие на капли жира, которые обладают идеальной симметрией.

Прямо сейчас одна из них находится слева от этого длинного жирного участка. Это одна единственная икринка. Теперь я возьму口-пипетку, захвачу икринку и перенесу её в дополнительную поддерживающую среду, чтобы мы могли изолировать сами икринки.

Сегодня я продемонстрировал вам, как выделить циты из женских репродуктивных путей. Кроме того, я показал вам различные структуры яйцевода. В частности, воронку (инфундибулум), которая является единственной структурой, в которую можно вводить среду FHM.

Используйте иглу калибра 30 G. С помощью этого метода я выделил ооциты и любые эмбрионы, находившиеся в репродуктивных путях самки. Я могу использовать их для исследований экспрессии генов или для создания трансгенных линий.