Анализ Ответы Мышь обонятельной сенсорных нейронов Использование воздушного фазы Electroolfactogram Запись

Препарат обонятельного эпителия устанавливается на чашку и помещается в струю увлажненного воздуха. Под рассекающим микроскопом электрод сравнения электрически соединяется с тканью через буферный раствор. Записывающий электрод размещается на поверхности обонятельного эпителия.

Обонятельный эпителий стимулируется управляемыми компьютером затяжками одорантов, вводимыми в поток увлажненного воздуха, который переносит одоранты в обонятельный эпителий. Сигналы ЭОГ передаются через усилитель и дигитайзер на записывающий компьютер. Здравствуйте, меня зовут Кэтрин Сиар из лаборатории гигиены XO биологического факультета Университета Джона Хопкинса.

Сегодня мы покажем вам процедуру записи электро олф факто граммы у мышей. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения реакции обонятельных сенсорных нейронов на запахи. Итак, приступим.

Регистрирующее устройство состоит из записывающего электрода, трубки подачи воздуха, предметного столика и препарирующего микроскопа, закрепленных на воздушном столе в клетке Фарадея. Манипуляторы Microm используются для размещения электродов в трубке подачи воздуха. Непрерывный поток воздуха пузырчато пропускается через дистиллированную воду для добавления влажности перед прохождением через воздухоподающую трубку и над образцом.

В качестве монтажной поверхности для образца используется 60-миллиметровая чашка для культур, наполненная сардой для адаптации от шести до восьми миллиметров. Колодец и канал выдолблены в монтажной тарелке. Обеспечить средства для электрического соединения электрода сравнения с образцом с помощью модифицированного раствора кольцевика.

Записывающий электрод и электрод сравнения подключены к усилителю. Сигналы от усилителя поступают на дигитайзер, а затем на компьютер. Программное обеспечение XI Graph используется для управления протоколом стимуляции, записи сигнала и анализа реакций.

После усилителя подключается осциллограф для контроля электрического потенциала в режиме реального времени при размещении записывающего электрода. И во время записи EOG. Подача одорантовых стимулов контролируется пико-шпритцером, который подключен к тому же компьютеру, который используется для сбора сигнала непосредственно перед подачей одоранта.

Выход пико-распылителя подключается к флакону с одорантом, содержащим жидкий одорант. Затем бутылка подключается к трубке подачи воздуха. Теперь давайте рассмотрим, как подготовить электроды для записи экспериментов.

Записывающий электрод представляет собой хлоридную серебряную проволоку в натянутом стеклянном капилляре, заполненном модифицированным раствором рингера. Электрод сравнения представляет собой хлоридную серебряную проволоку. Начните подготовку обоих электродов с установки серебряной проволоки в электрододержатель.

Для регистрирующего электрода от конца электрододержателя должен выступать один-два сантиметра провода. Для электрода сравнения можно оставить больше провода. Чтобы добавить покрытие из хлорида серебра, поместите провод в 0,1 молярного хлорида натрия и подключите держатель электрода к положительной клемме источника постоянного тока от 1,5 до 9 вольт.

Отрицательная клемма источника питания должна быть электрически подключена к 0,1 молярному раствору хлорида натрия. Дайте хлориду в реакции протекать в течение 10 минут, чтобы выровнять статический заряд между записывающим электродом и электродом сравнения. Коротко коснитесь электродов друг о друга, прежде чем установить их на записывающее устройство.

Затем потяните стеклянный капилляр с помощью микропипетки. Отверстие на кончике капилляра должно быть от пяти до 10 микрон в диаметре. Алмазным карандашом надрежьте и отломите тупой конец капилляра так, чтобы он был примерно на два сантиметра длиннее серебряной проволоки.

Используйте бутановую горелку для огневой полировки срезанный конец, теперь расплавьте 0,5% агроса в модифицированном растворе кольца. С помощью переводной пипетки втяните небольшое количество расплавленного агрораствора в кончик электрода с помощью нагретого и вытянутого шприца с длинным тонким концом. Заполните вытянутый капилляр примерно наполовину.

С помощью модифицированного раствора для кольца осторожно переверните капилляр, чтобы удалить пузырьки воздуха. Храните заполненный электрод в банке для хранения с небольшим количеством модифицированного раствора для кольцевания на дне до тех пор, пока он не будет готов к использованию. После того, как образец ткани подготовлен и готов к записи, установите заполненный капилляр поверх провода записывающего электрода с готовыми электродами.

Давайте рассмотрим эксперимент по записи, чтобы начать подготовку тканей к записи. Снимите кожу над черепом принесенной в жертву мыши и рассеките голову пополам по средней линии крепления одной половиной головы медиальной стороной вверх на монтажной тарелке. Осторожно удалите перегородку, чтобы обнажить носовые раковины.

Поместите чашку с установленной салфеткой на столик для записи. Выровняйте предметный столик так, чтобы место записи на носовых раковинах было по центру под микроскопом. Теперь включите воздушный бак, чтобы увлажненный воздух подавался на поверхность носовых раковин со скоростью около 600 миллилитров в минуту.

Расположите трубку подачи воздуха так, чтобы она находилась на расстоянии примерно 10 миллиметров от места записи. Установите усилитель в режим постоянного тока, так как усиление переменного тока вызовет артефакты в сигнале EOG. Получение данных осуществляется с помощью фильтра нижних частот в один килогерц и коэффициента усиления 100x.

Теперь установите записывающие электроды и электроды сравнения на микроманипуляторы. Опустите электрод сравнения в лунку на монтажной чашке и залейте его модифицированным раствором для кольцевания таким образом, чтобы он был электрически соединен с тканью. Осторожно опустите записывающий электрод на поверхность носовых раковин два, Б или три.

Электрод должен едва касаться поверхности обонятельного эпителия. Когда электрод соприкасается с эпителием, на осциллографе появляется прямая базовая линия. Теперь прикрепите флакон с одорантом к боковому порту на трубке подачи воздуха на компьютере.

Начните протокол стимуляции. Частота дискретизации для сбора данных должна составлять два килогерца или выше. Программное обеспечение запустит импульс запаха и начнет запись.

Типичный протокол стимуляции может быть длительностью 100 миллисекунд, один импульс в паре, 100 миллисекундных импульсов, разделенных интервалом в одну секунду, или десятисекундный непрерывный импульс. Чтобы свести к минимуму адаптацию, подождите от одной до пяти минут между протоколами после подачи высоких концентраций запаха. Остаточный запах может остаться в трубке, промойте воздушную трубку 95% этанолом и высушите, прежде чем продолжить изучение дополнительных образцов ткани.

Программное обеспечение Axo graft предоставляет инструменты для измерения ключевых параметров сигнала EOG. К таким параметрам относятся амплитуда отклика, задержка, время до пика и временные константы завершения. Некоторые параметры EOG особенно полезны для сравнения нормализованных ответов у мышей, включая амплитуду ответа, время нарастания латентности, время до пика и постоянную времени окончания.

Здесь показаны ОГ мыши в ответ на стимуляцию с увеличением концентрации жидкого амилацетата. Черная линия вверху указывает на время и продолжительность стимуляции одоранта. Здесь мы видим, что отношение «реакция на дозу», усредненное по пяти полосам погрешности мышей, составляет 95% доверительных интервалов.

Снижение пиковой амплитуды часто наблюдается при очень высоких концентрациях запаха. В качестве примера ЭОГ в ответ на парную импульсную стимуляцию показано, что один короткий импульс одоранта вызывает адаптацию в течение нескольких секунд. Здесь показана ЭОГ в ответ на 10 секунд продолжительной стимуляции запахом.

EOG демонстрирует десенсибилизацию при непрерывном представлении одоранта. Мы только что показали вам, как записать грамму электродного фактора у мышей. При выполнении этой процедуры важно помнить, что электрод должен располагаться только на поверхности эпителия и не проникать внутрь электрода под поверхность.

Всегда записывайте с одной и той же стороны головы и избегайте изменений в настройке, чтобы свести к минимуму вариации, поддерживайте влажность ткани, но не собирая капли жидкости, поместите ткань под увлажненный воздух сразу после вскрытия, чтобы сохранить ткань в наилучшем состоянии для записи. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.