Выделение и Обогащение Крыса мезенхимальные стволовые клетки (МСК) и разъединении одной колонии Производные МСК

Мезенхимальные стволовые клетки, сокращенно MSCs, выделяют из самки крысы породы Rag Dolly в возрасте от шести до восьми недель и культивируют в чашке Петри диаметром 10 см до достижения примерно 80% конфлюэнтности. Для обогащения популяции MSCs клетки окрашивают первичными антителами, конъюгированными с биотином, с последующим добавлением магнитных бусин, конъюгированных со стрептавидином. Затем меченые клетки разделяют на две фракции — отрицательную и положительную — с помощью метода магнитной сепарации клеток (MACS).

Затем для подтверждения экспрессии поверхностных маркеров используется анализ методом проточной цитометрии. В завершение применяются клонирующие цилиндры для получения МСК, производных от единичных колоний. Здравствуйте, меня зовут Ли, я представляю лабораторию Кристины Чанг на кафедре химического машиностроения и материаловедения Университета штата Мичиган.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру выделения и обогащения стволовых клеток chy, а также получения клеток, производных от одиночных колоний. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения пролиферации и дифференцировки красных стволовых клеток. Итак, приступим.

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) будут выделены из самки крысы породы Sprague-Dawley в возрасте от шести до восьми недель. Для начала процедуры ампутируйте бедренные и большеберцовые кости задних конечностей эвтаназированного животного. Удалите кожу и мышцы, поместите препарированные бедренные и большеберцовые кости в 70% изопропанол на несколько секунд, а затем перенесите их в 1× DPBS.

Следующие действия следует выполнять в боксе биологической безопасности. Сначала перенесите бедренную и большеберцовую кости в чашку диаметром 10 сантиметров с DMEM. Затем, удерживая каждую кость пинцетом, разрежьте оба конца ножницами.

Прикрепите иглу 22 gauge к трехмиллилитровому шприцу и заполните его DMEM. Введите иглу в один из открытых концов кости и промойте костный мозг в пробирку объемом 50 мл. Повторите процедуру два или три раза для каждой кости до полного извлечения костного мозга.

Перевзбейте клетки, затем пропустите клеточную суспензию через клеточный фильтр с порами 70 мкм, чтобы удалить костные остатки и агрегаты крови. Центрифугируйте клетки при 200 ×g при температуре 4 °C в течение пяти минут. После удаления супернатанта путем аспирации перевзбейте клетки в 25 мл среды для посева MSC.

Перенесите по 10 миллилитров клеточной суспензии в каждую из двух культуральных чашек диаметром 10 сантиметров. Инкубируйте культуральные чашки в инкубаторе при 37 °C и 5% carbon dioxide в течение одной-двух недель. Когда ранее выделенные МСК крысы достигнут конфлюэнтности около 80%, аспирируйте среду и добавьте по четыре-пять миллилитров трипсина-EDTA в каждую чашку.

Верните чашки в инкубатор и инкубируйте примерно в течение пяти минут. Чтобы обеспечить открепление клеток, добавьте равный объем культуральной среды для инактивации трипсина. Соберите клеточные суспензии в пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте клетки при 200 GS при температуре четырех градусов Цельсия в течение пяти минут.

Теперь мы продемонстрируем обогащение МСК по двум поверхностным маркерам, CD 54 и CD 90. Для этого будет использован магнит BD I — магнит для сепарации клеток от BD Biosciences. Начните с ресуспендирования клеточного осадка в буфере для окрашивания клеток до концентрации 20 миллионов клеток на миллилитр.

Затем добавьте к клеточной суспензии биотинилированные антитела к CD 54 и CD 90, осторожно перемешайте и инкубируйте на льду в течение 15 минут. Промойте меченые клетки избыточным объемом 1X буфера BD IMAG. Центрифугируйте меченые клетки при 200 ×g и 4 °C в течение пяти минут. Подготовьте частицы стрептавидина BD IMAG, тщательно перемешав их на вортексе, затем добавьте 40 µL частиц на каждые 10 миллионов клеток.

Тщательно перемешайте частицы с мечеными клетками и инкубируйте клетки при температуре от 6 до 12 °C в течение 30 минут. Во время инкубации подпишите пробирку с круглым дном для сбора положительной фракции. По завершении инкубации доведите концентрацию меченых клеток до 20 миллионов клеток на мл.

С помощью одного буфера для магнитного разделения Expedia I перенесите меченые клетки в пробирку для сбора положительной фракции. Поместите пробирку с положительной фракцией на магнит BDI и оставьте ее на шесть минут.

Затем, пока пробирка с положительной фракцией все еще находится на магните BDI, удалите супернатант с помощью стеклянной пастернавской пипетки. Затем снимите пробирку с положительной фракцией с магнита BDI и поместите ее на лед. Добавьте 1 mL буфера XBDI mag и ресуспендируйте клетки путем осторожного перемешивания.

Снова поместите пробирку на магнит BDI и оставьте её на две-четыре минуты. Удалите супернатант с помощью новой стеклянной пастернауэровской пипетки. Повторите промывку, как описано выше.

Повторите процедуру еще раз. Наконец, удалите супернатант новой стеклянной пастернауэровской пипеткой. Затем извлеките пробирку из магнитного сепаратора BDI.

Суспендируйте клетки в одном миллилитре культурной среды и перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую 25 миллилитров среды. 1 квадратный флакон 75 сантиметров для поддержания клеток. И чашку 10 сантиметров для проточной цитометрии.

Чтобы начать процедуру выделения МСК из единичных колоний, высейте клетки с плотностью примерно 50–100 клеток на чашку диаметром 10 см и инкубируйте в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение одной или двух недель. В течение этого периода исследуйте хорошо изолированные колонии с помощью инвертированного микроскопа. Как только колонии достигнут достаточного размера (более 100 клеток в каждой), отметьте их перманентным маркером на дне чашки.

При выборе колонии для маркировки убедитесь, что рядом с ней нет других колоний. Аспирируйте среду и один раз промойте чашку X-D-P-B-S с помощью пинцета. Возьмите стерильный цилиндр для клонирования и осторожно поместите его вокруг маркированной колонии.

Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока над каждой помеченной колонией не будет установлен цилиндр для клонирования. Добавьте по 100 µL трипсина-EDTA в каждый цилиндр и верните чашку в инкубатор. Через пять минут проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что они стали округлыми.

Когда клетки открепятся, добавьте равный объем культуральной среды для инактивации трипсина. Перемешайте клеточную суспензию с помощью микропипетки на 200 µL и перенесите ее в чашку диаметром 60 мм, содержащую 3 mL предварительно нагретой культуральной среды. Подпишите чашки и поместите их обратно в инкубатор для адгезии пластика после изоляции.

МСК должны стать видимыми на следующий день после посева. По мере дальнейшей пролиферации клеток слияние должно выглядеть так, как показано на данном фазово-контрастном изображении, где большинство клеток имеют веретенообразную или звездообразную форму; пересадка культур целесообразна, когда клетки достигают примерно 80% конфлюэнтности.

После трипсинизации отделившиеся клетки должны стать округлыми и плавать в среде. После обогащения МСК с помощью магнитной сепарации клеток проводят проточную цитометрию для проверки экспрессии поверхностных маркеров. При успешном обогащении клетки должны проявлять положительное окрашивание на маркеры МСК CD 54 и CD 90, но отрицательное — на маркер ГСК CD 45; в качестве отрицательного контроля используются изотипические контроли IgG 2A и IgG 1.

При правильной плотности посева клеток колонии должны вырастать из одиночных клеток, как показано в данном примере. Затем с помощью клонирующих цилиндров можно разделить колонии, а полученные из них клетки культивировать по отдельности. В этих двух примерах клетки, полученные из одной колонии, имеют веретеновидную форму, тогда как клетки из другой колонии — округлую.

Таким образом, мы продемонстрировали вам способы изоляции и обогащения популяций случайных и общих стволовых клеток, а также метод получения клеток, происходящих из единичных колоний. В ходе данной процедуры важно не забыть удалить сгустки крови и костный детрит на этапе изоляции. При обогащении используйте оптимальное количество антител, а при разделении колоний тщательно маркируйте хорошо изолированные колонии.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.