Экспрессия рекомбинантных белков в метилотрофных дрожжей Pichia pastoris

В данном протоколе описывается экспрессия белка с использованием дрожжей с делецией MET15. Показаны этапы подготовки электрокомпетентных клеток дрожжей и трансформация вектора с целевым геном в клетки, после чего следует этап очистки ДНК дрожжей для проверки правильности интеграции вашего целевого гена в геном дрожжей. В завершение мы проведем экспрессию рекомбинантного белка.

Здравствуйте, я Мария из лаборатории Стивена Халлема факультета микробиологии и иммунологии Университета Британской Колумбии. А я Маркус, также из лаборатории Халлема. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру экспрессии рекомбинантных белков в дрожжах TRO PQ.Past stories.

В нашей лаборатории мы используем данную процедуру для изучения белков некультивируемых микроорганизмов, из которых была экстрагирована и архивирована метагеномная ДНК, а также метагеномных библиотек. Итак, приступим. Экспрессия рекомбинантных белков в дрожжах Pichia pastoris требует клонирования интересующего вас гена в рамке считывания в подходящий вектор для P. pastoris.

В нашем эксперименте мы используем вектор PPIC Z alpha A. Этот вектор содержит промотор AO X one для строго регулируемой метанол-индуцируемой экспрессии целевого гена, сигнал секреции alpha-фактора для секреции рекомбинантного белка, ген устойчивости zaas для селекции как в e coli, так и в pic, а также C-концевой пептид, содержащий эпитоп acemic и полигистидиновый тег для детекции и очистки рекомбинантного белка. Перед трансформацией линеаризуйте вектор, содержащий ваш целевой ген, с помощью рестрикционного анализа. Мы используем фермент PME one, но возможны и другие сайты рестрикции, при условии, что ваша вставка не содержит данного сайта рестрикции.

Для получения достаточного количества линеаризованной векторной ДНК проведите три или четыре реакции рестрикционного расщепления в объеме 50 µL в отдельных пробирках; после расщепления объедините все растворы и сконцентрируйте вашу конструкцию. Используя центрифужный фильтр-насадок AmCon и центрифужный фильтр-насадок MicroCon, вам потребуется от 5 до 20 µg линеаризованной ДНК в 5–10 µL стерильной воды для трансформации в PPA dous. Для подготовки электрокомпетентных клеток PPA dous за четыре дня до предполагаемой трансформации посейте клетки штрихом на чашки с AYPDS без SN, культивируйте при 30 °C в течение одного или двух дней или до образования одиночных колоний за два дня до трансформации.

Вырастите пять миллилитров PPA или штамма в среде YPD в пробирке Falcon объемом 50 мл при 30 °C в течение ночи. За день до трансформации поместите пробирку Falcon в колбу, чтобы закрепить ее в шейкере. Используйте 0,25 мл ночной культуры для инокуляции 500 мл свежей среды YPD в колбе объемом два литра.

Снова культивируйте клетки в шейкере при 30 °C в течение ночи до достижения OD 600 от 1,3 до 1,5. В день трансформации подготовьте лед, холодную стерильную воду и 1 М раствор сорбитола. Центрифугируйте клетки при 1500 ×g в течение пяти минут при 4 °C.

После центрифугирования осадок суспендируют в 500 миллилитрах ледяной стерильной воды. В зависимости от вместимости центрифужных пробирок может потребоваться разделить объем на две отдельные пробирки или провести несколько циклов. Повторно центрифугируют клетки и ресуспендируют осадок в 250 миллилитрах ледяной стерильной воды.

В зависимости от объема центрифужных пробирок можно объединить отдельные осадки клеток в одну пробирку. После центрифугирования снова ресуспендируйте осадок клеток. Перенесите ресуспендированные клетки в 20 мл ледяного 1 M сорбитола в пробирку Falcon объемом 50 мл и центрифугируйте.

После финального центрифугирования ресуспендируйте осадок в одном миллилитре ледяного 1 M сорбитола до конечного объема примерно 1,5 мл. Ресуспендированные клетки в микроцентрифужных пробирках храните на льду или при температуре 4 °C до момента их использования для трансформации. Перед трансформацией концентрированного линеаризованного конструкта в клетки PPA подготовьте следующие реагенты и оборудование.

Наполните микроцентрифужную пробирку 1 mL 1 M сорбитола и поместите ее на лед. Поместите электропорационную кювету объемом 0,2 см на лед.

Маркируйте стерильную стеклянную пробирку объемом 15 мл и подготовьте стерильный стеклянный наконечник для вашей пипетки. Перенесите 80 µL ранее подготовленных электрокомпетентных клеток в охлажденную на льду кювету для электропорации с зазором 0.2 см.

Добавьте раствор плазмидной ДНК к клеткам и перемешайте, перемещая наконечник пипетки из стороны в сторону. В кювете для электропорации. Инкубируйте кювету с клетками на льду в течение пяти минут.

Затем протрите внешнюю сторону кюветы салфеткой и проведите импульсную электропорацию клеток в соответствии с параметрами для почкующихся дрожжей, рекомендованными производителем вашего конкретного устройства для электропорации. В данной демонстрации используется BioRad gene Pulser со следующими условиями: напряжение зарядки 1500 вольт, емкость 25 micro ferres и сопротивление 200 ohms непосредственно после импульса.

Добавьте один миллилитр ледяного 1 M сорбитола в пробирку. Перенесите содержимое пробирки в стерильную трубку объемом 15 мл с помощью стерильной стеклянной пастернаковской пипетки. Инкубируйте трубку при 30 °C без встряхивания в течение 1,5 часов.

Через 1,5 часа электропорированные клетки будут готовы к посеву. В каждую из четырех промаркированных чашек с YPTS, содержащих 100 µg/mL Zain, добавьте от пяти до 10 стерилизованных стеклянных шариков. Рассейте 250 µL продукта электропорации.

Перемешайте содержимое каждой чашки и встряхните её в горизонтальном направлении, чтобы равномерно распределить клетки. Дайте чашкам высохнуть в течение 15 минут, затем удалите гранулы из агара, перевернув чашки. Оберните чашки в черный пластик, чтобы предотвратить деградацию светочувствительного Zain, и инкубируйте их в перевернутом положении в течение двух-трех дней при температуре 30 °C до появления колоний.

Отберите 12 колоний. Очистите их путем пересева клонов на свежие чашки с YPDS, содержащие 100 µg/mL зеина. Для подготовки клеток PPA к экспрессии белка отберите одну колонию из очищенных колоний Pichia и инокулируйте в 25 mL среды VMGY в стерильной колбе объемом 250 mL; культивируйте при 30 °C в шейкере-инкубаторе до достижения культурой OD 600 от двух до шести.

Когда клетки достигнут соответствующего значения OD 600, подготовьте глицериновый сток клеток для хранения. Перенесите 800 µL клеточной культуры в криопробирку объемом 2 мл и добавьте 200 µL стерилизованного глицерина. Храните глицериновый сток при температуре -80 °C.

Кроме того, перенесите 1,5 milliliters клеточной культуры в микроцентрифужную пробирку. Соберите клетки путем центрифугирования при 1300 GS в течение одной минуты при комнатной температуре. Храните осадок при температуре four degrees Celsius.

Эти клетки будут использованы для очистки ДНК дрожжей с целью анализа плазмид pichia после ПЦР со специфическими праймерами к вставке на агарозном геле, чтобы подтвердить интеграцию целевого гена в геном pichia. Перенесите оставшуюся часть 25 мл культуры в 50 мл пробирку Falcon и осадите клетки путем центрифугирования при 3000 Gs в течение пяти минут при комнатной температуре; слейте супернатант и поместите пробирку вверх дном на салфетку, чтобы удалить остатки среды. Для промывки клеточного осадка ресуспендируйте его с помощью вортекса или пипетирования в 20 мл среды BMMY, затем центрифугируйте.

После декантирования супернатанта повторно суспендируйте клеточный осадок путем вортексирования или пипетирования до достижения OD 600 равной 1.0 в среде BMMY, предназначенной для индуцирования экспрессии. Перенесите культуру в литровую колбу с перегородками и закройте её колпачком объемом 200 мл.

Мы настоятельно рекомендуем использовать колбы с перегородками (бейфлами), так как они обеспечивают более интенсивное насыщение культуры кислородом. Для эффективной экспрессии белка при индукции метанолом поместите колбу в инкубатор для продолжения роста при 30 °C. Важно, чтобы температура не превышала 30 °C, если температура в вашем инкубаторе подвержена колебаниям.

Установите температуру на 28 °C. Каждые 24 часа добавляйте стерильный чистый метанол до конечной концентрации 0,5% метанола для поддержания индукции; в определенные моменты времени после начала экспрессии перенесите один миллилитр культуры в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и центрифугируйте при 1300 Gs в течение 2,5 минут. При комнатной температуре перенесите супернатант в отдельную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра.

Храните супернатант и клеточные осадки при температуре -80 °C до проведения дальнейшего анализа. Образцы, полученные в разные моменты времени, будут проанализированы для определения оптимального периода экспрессии белка после индукции. Ниже представлены репрезентативные результаты успешной экспрессии рекомбинантных белков с использованием PIA Pastis в качестве системы-хозяина.

На данном изображении вестерн-блоттинга показаны четыре экспрессированных белка через 24 часа экспрессии. Для иммуноблоттинга использовались антитела acemic HRP. Вторая дорожка является отрицательным контролем; на нее был нанесен супернатант клеток, не экспрессирующих рекомбинантный белок, так как они были трансформированы родительским вектором.

Мы только что продемонстрировали вам способ экспрессии рекомбинантных белков с использованием эукариотического хозяина PQ.Plus. При выполнении данной процедуры важно предварительно секвенировать вашу конструкцию, чтобы подтвердить, что целевой ген клонирован и находится в правильной рамке считывания, а также подготовить все чашки и реагенты до начала работы. Также важно подготовить достаточное количество линеаризованной плазмиды, чтобы получить большое число трансформантов перед экспрессией белка путем индукции метанолом. Обязательно тщательно промойте клеточный осадок, чтобы удалить любые остатки глицерина, которые могут подавлять экспрессию белка.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в проведении экспериментов.