Оплодотворение Xenopus ооцитов Использованием метода передачи хост

Общая цель данной процедуры заключается в получении развивающихся эмбрионов, полученных из участков оогенеза (OO sites), которые подвергались манипуляциям в культуре. Это достигается путем первоначального выделения донорских участков оогенеза у одной самки и проведения с ними необходимых манипуляций в культуре. Вторым этапом процедуры является стимуляция созревания этих цитов с помощью прогестерона и введение самкам-реципиентам гонадотропина для стимуляции откладки икры.

Третьим этапом процедуры является окрашивание донорских цитов витальными красителями и подготовка самки, которая будет служить реципиентом. Заключительный этап процедуры заключается в хирургическом переносе донорских цитов в полость тела реципиента, после чего через несколько часов извлекают и оплодотворяют перенесенные яйцеклетки. В итоге получают нормально делящиеся эмбрионы, полученные от экспериментально модифицированного донора.

Цитопласту можно получать и анализировать точно так же, как и обычные эмбрионы. Здравствуйте, я Дуг Хьюстон из Университета Айовы. Сегодня мы находимся на курсе Xap в Колд-Спринг-Харбор, чтобы показать вам, как выполнять процедуру переноса реципиенту.

Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения функций продуктов материнских генов и определения их роли на ранних стадиях развития зебраданио. Итак, приступим. Перед началом операции убедитесь, что операционная зона продезинфицирована, а свежая среда и стерильные инструменты подготовлены.

Зажмите шовную иглу в иглодержателе в нужном положении. Поместите анестезированную самку лягушки на спину на влажную хирургическую салфетку. Используя маленькие ирисные ножницы, сделайте разрез кожи длиной один сантиметр в нижней части живота, латеральнее срединной линии.

Не разрезайте брюшную мышцу. Используйте пинцет, чтобы приподнять мышечный слой и окружающую белую фасцию. С помощью ирисных ножниц сделайте один быстрый разрез вертикально вниз сквозь мышцу.

Увеличьте разрез до одного сантиметра, чтобы обнажить яичник. С помощью пинцета захватите яичник и вытяните дольку. Используя ножницы, отсеките дольку на уровне брюшной стенки.

Поместите ткань в чашку диаметром 90 мм, содержащую среду для культивирования ооцитов (OCM), и немедленно оцените качество яичника под диссекционным микроскопом. Несколько ооцитов можно выделить с помощью пинцета. Если ооциты плотные, однородного размера и окраски, удалите необходимое количество ткани яичника лягушки и перенесите её в чашку Петри диаметром 90 мм с OCM.

Зашейте разрез. Введите иглу в нескольких миллиметрах латеральнее разреза, убедившись, что она проходит и через мышцу, и через фасцию. Используйте пинцет для манипуляций с иглой, стараясь не вытягивать нить шва полностью.

Закройте рану, используя простые раздельные швы и хирургические квадратные узлы. Подробное описание данной техники приведено в сопроводительном тексте. Повторите наложение швов на кожном слое.

Промойте самку деионизированной водой и поместите ее в восстановительный бак с прохладной водой. Сразу после завершения операции с помощью ножниц разделите яичник на части. Разрежьте отдельные доли, расправьте их и нарежьте на кусочки размером 2 см².

Промойте чистой средой, используя пинцет. Перенесите от пяти до шести фрагментов в новую 90-миллиметровую чашку с OCM для изоляции отдельных цитов. Начните с переноса одного из фрагментов в маленькую чашку со средой и поместите под диссекционный микроскоп.

С помощью часового пинцета вручную отберите от 3 до 500 ооцитов. Второй парой пинцетов захватите слой соединительной ткани вокруг полностью созревшего ооцита шестой стадии рядом с основанием. Первой парой пинцетов захватите яичник, прилегающий к ооциту.

Слегка проведите по ооциту, чтобы разорвать слой фолликула. Осторожно отделите ооцит от ткани. Дефолликулированные ооциты не имеют видимых кровеносных сосудов и более мягкие, чем ооциты с сохранными фолликулами.

Используйте пипетку с огневым полированием кончика и ватным тампоном, чтобы перенести группы от 100 до 150 ооцитов в чашки для культивирования диаметром 60 миллиметров, содержащие восемь миллилитров OCM. Храните ооциты в чашках при температуре 18 °C. Теперь в ооциты можно провести микроинъекции антисмысловых олигонуклеотидов или мРНК в соответствии с любым из имеющихся протоколов, после чего культивировать их в среде OCM в инкубаторе при температуре 18 °C.

Используйте ооциты для переноса в течение 96 часов после выделения, начиная с вечера, предшествующего процедуре переноса. Инкубируйте необходимые ооциты с прогестероном для их созревания, добавив 16 µL 1 mM прогестерона в среду с ооцитами до конечной концентрации 2 µM. Инкубируйте от 10 до 12 часов при 18 °C в тот же вечер, затем введите трем-пяти самкам по 1000 единиц человеческого хорионического гонадотропина на одну лягушку для стимуляции откладки икры.

В утро переноса оставьте самок при комнатной температуре или 18 °C на ночь. Проверьте под диссекционным микроскопом, прошли ли культивируемые ооциты стадию созревания. Добавьте витальные красители и центрифугируйте при ускорении более 10 000 G в течение пяти минут.

Чтобы снизить фоновый сигнал от клеточного дебриса, добавьте 80 µL подходящего витального красителя к каждой экспериментальной группе ооцитов. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут на шейкере-балансире. Перенесите окрашенные яйцеклетки в чашку диаметром 90 мм со свежей средой o cm и осторожно перемешайте для промывки.

Изготовьте пипетку для переноса цитов. С помощью алмазного резца сделайте надрез на пастеровской пипетке примерно в двух сантиметрах ниже конусообразной части и аккуратно отломите ее. В результате должна получиться пипетка с отверстием диаметром 1,5 мм, которого достаточно для размещения ооцита.

Отшлифуйте кончик до гладкости краев, не закрывая его. Трансплантация ооцитов. Хирургическое вмешательство следует проводить максимально быстро.

Сделайте разрез, как описано ранее, у анестезированной самки, откладывающей яйца хорошего качества. Длина этого разреза должна быть минимальной, достаточной лишь для того, чтобы в него поместилось отверстие трубки для переноса. С помощью пипетки отберите менее одного сантиметра.

Повращайте чашку с экспериментальными ооцитами, чтобы собрать их в центре. С помощью подготовленной пастур-пипетки отсосите как можно больше ооцитов. Дайте ооцитам осесть на конце пипетки, чтобы минимизировать объем жидкости, переносимой лягушке.

С помощью пинцета захватите и приподнимите один лоскут мышц и фасции. Введите кончик пипетки в разрез и медленно позвольте ооцитам стечь в полость тела. Повторяйте процедуру до тех пор, пока все ооциты не будут перенесены.

Не отпускайте мышечный слой, чтобы предотвратить выпадение ооцитов из разреза. С помощью пинцета захватите оба края разреза и соедините их, позволяя цитам переместиться в полость тела. Начните накладывать швы на мышечный слой и фасцию, как и прежде, стараясь поддерживать натяжение вверх до завязывания первого узла.

Зашейте кожу. Промойте лягушку деионизированной водой и дайте ей восстановиться, как и ранее. Лягушка должна начать нормально откладывать икру спустя два-три часа после операции.

Сбор икры осуществляйте путем обычного сжатия каждые полчаса до тех пор, пока самка не перестанет ее откладывать, собирая икру в специальную емкость. Добавьте четыре миллилитра суспензии свежесобранной спермы в среде one XMMR и инкубируйте при комнатной температуре в течение четырех минут. Обильно промойте икру раствором комнатной температуры.

Добавьте одну точку XMMR и инкубируйте при комнатной температуре для активации и расщепления. На любом этапе можно использовать цистеин для удаления желеобразных оболочек. Перенесенные эмбрионы затем можно распределить по отдельным чашкам в зависимости от цвета и культивировать как обычные эмбрионы.

Как правило, более двух третей перенесенных икринок активируются в течение нескольких минут после оплодотворения, демонстрируя выраженное сокращение кортикального слоя на анимальном полюсе. В большинстве экспериментов более половины перенесенных икринок проходят нормальное первое дробление. В нашей практике иногда наблюдается задержка дробления примерно на 20 минут по сравнению с икринками-хозяевами.

От 30 до 60% перенесенных эмбрионов нормально проходят стадию гаструляции и выживают после стадии нейруляции. Перенесенные эмбрионы сохраняют цвет витального красителя на протяжении многих дней развития. Эмбрионы, полученные из неинъецированных контрольных ооцитов, будут выглядеть нормально, как и ожидалось.

Напротив, эмбрионы, полученные из ооцитов, в которые вводили бета-катенин и антисмысловые олигонуклеотиды, будут иметь центрированный вид. Мы только что показали вам, как получить эмбрионы из ооцитов, манипуляций с которыми проводились в культуре.

При выполнении данной процедуры важно использовать здоровые зрелые ооциты донора и самок-реципиентов с яйцеклетками высокого качества. Кроме того, успех метода обычно коррелирует со скоростью изоляции ооцитов и проведения хирургических операций. Таким образом, для достижения стабильных результатов может потребоваться определенная практика.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.