Оплодотворение Xenopus ооцитов Использованием метода передачи хост

Общая цель данной процедуры заключается в получении развивающихся эмбрионов, полученных из участков яичников (OO sites), которые подвергались манипуляциям в культуре. Это достигается путем первоначального выделения донорских участков яичников у одной самки и проведения с ними необходимых манипуляций в культуре. Вторым этапом процедуры является стимуляция созревания этих цитов с помощью прогестерона и введение самкам-реципиентам гонадотропина для стимуляции откладки икры.

Третьим этапом процедуры является окрашивание цитов донора витальными красителями и подготовка самки, которая будет служить реципиентом. Заключительный этап процедуры заключается в хирургическом переносе цитов донора в полость тела реципиента с последующим извлечением и оплодотворением перенесенных яиц через несколько часов. В конечном итоге получаются нормально делящиеся эмбрионы, полученные от экспериментально манипулированного донора.

Цитопласты можно получить и проанализировать так же, как и обычные эмбрионы. Здравствуйте, я Даг Хьюстон из Университета Айовы. Сегодня мы находимся на курсе по Xap в Cold Spring Harbor, чтобы показать вам, как проводить процедуру переноса хозяину.

Мы используем данную процедуру в нашей лаборатории для изучения роли продуктов материнских генов и определения их функций на ранних стадиях развития zap. Итак, приступим. Перед началом операции убедитесь, что операционное поле продезинфицировано, а свежая среда и стерильные инструменты подготовлены.

Зажмите шовную иглу в иглодержателе в нужном положении. Поместите анестезированную самку лягушки на спину на влажную хирургическую салфетку. С помощью малых ирисных ножниц сделайте разрез кожи длиной один сантиметр в нижней части живота латеральнее срединной линии.

Не прорезайте брюшную мышцу. Используйте пинцет, чтобы приподнять мышечный слой и окружающую белую фасцию. Используя ирисные ножницы, сделайте один быстрый разрез вертикально вниз через мышцу.

Увеличьте разрез до одного сантиметра, чтобы обнажить яичник. С помощью пинцета захватите яичник и вытяните одну из его долей. Используя ножницы, отсеките долю на уровне брюшной стенки.

Поместите ткань в чашку диаметром 90 мм, содержащую среду для культивирования ооцитов (OCM), и немедленно оцените качество яичника под диссекционным микроскопом. С помощью пинцета можно удалить несколько ооцитов. Если ооциты плотные, однородного размера и окраски, удалите необходимое количество ткани яичника лягушки и поместите её в чашку Петри диаметром 90 мм с OCM.

Зашейте разрез. Введите иглу в нескольких миллиметрах латеральнее разреза, убедившись, что она проходит через мышцу и фасцию. Используйте пинцет для манипуляций с иглой, стараясь не вытягивать нить шва полностью.

Закройте рану с помощью простых раздельных швов и хирургических квадратных узлов. Данная техника подробно описана в сопровождающем тексте. Повторите наложение швов на кожном слое.

Промойте самку деионизированной водой и поместите её в емкость для восстановления с прохладной водой. Сразу после завершения операции с помощью ножниц разделите яичник на части. Разрежьте отдельные доли, расправьте их и нарежьте на фрагменты размером 2 см².

Промойте чистой средой, используя пинцет. Перенесите пять-шесть фрагментов в новую 90-миллиметровую чашку с OCM для изоляции отдельных цитов. Начните с переноса одного из фрагментов в маленькую чашку со средой и поместите её под диссекционный микроскоп.

С помощью часового пинцета вручную отберите от 3 до 500 ооцитов. Захватите слой соединительной ткани, окружающий полностью созревший ооцит шестой стадии, рядом с основанием, используя вторую пару пинцетов. Захватите яичник рядом с ооцитом первой парой пинцетов.

Слегка проведите по ооциту, чтобы разорвать слой фолликула. Осторожно отделите ооцит от ткани. Дефолликулированные ооциты не имеют видимых кровеносных сосудов и более мягкие, чем ооциты с сохранными фолликулами.

Используйте пипетку с огненной полировкой и ватным пробком для переноса групп от 100 до 150 ооцитов в чашки для культивирования диаметром 60 миллиметров, содержащие восемь миллилитров OCM. Храните ооциты в чашках при температуре 18 °C. Теперь в ооциты можно провести микроинъекции антисмысловых олигонуклеотидов или мРНК в соответствии с любым из доступных протоколов, после чего их следует культивировать в OCM в инкубаторе при температуре 18 °C.

Используйте ооциты для переноса в течение 96 часов после выделения, проводя процедуру вечером накануне переноса. Инкубируйте необходимое количество ооцитов с прогестероном для их созревания, добавив 16 µL 1 mM прогестерона в среду с ооцитами до достижения конечной концентрации 2 µM. Инкубируйте от 10 до 12 часов при 18 °C в тот же вечер, затем введите трем-пяти самкам по 1000 единиц хорионического гонадотропина человека на одну лягушку для стимуляции откладки икры.

В утро пересадки оставьте самок при комнатной температуре или 18 °C на ночь. Проверьте под диссекционным микроскопом, прошли ли культивируемые ооциты процесс созревания. Добавьте витальные красители и центрифугируйте при ускорении более 10 000 G в течение пяти минут.

Для снижения фонового сигнала от клеточного дебриса добавьте по 80 µL соответствующего витального красителя в каждую экспериментальную группу ооцитов. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут на ротаторе. Перенесите окрашенные яйцеклетки в чашку диаметром 90 мм со свежей o cm и осторожно перемешайте для их промывки.

Изготовьте пипетку для переноса цитов. С помощью алмазного резца сделайте надрез на пастеровской пипетке примерно в двух сантиметрах ниже конусообразной части и аккуратно отломите кончик. В результате должна получиться пипетка с отверстием диаметром 1.5 millimeter, которого будет достаточно для размещения ооцита.

Шлифуйте кончик до тех пор, пока края не станут гладкими, не допуская закрытия отверстия. Трансплантация ооцитов. Хирургическое вмешательство следует проводить максимально быстро.

Сделайте разрез, как описано ранее, у анестезированной самки, откладывающей качественные яйца. Длина разреза должна быть минимальной, достаточной лишь для того, чтобы в него поместилось отверстие переносящего устройства. С помощью пипетки отберите менее одного сантиметра.

Слегка покачайте чашку с опытными ооцитами, чтобы они собрались в центре. С помощью подготовленной пастуровской пипетки отсосите как можно больше клеток. Дайте ооцитам осесть на кончик пипетки, чтобы минимизировать объем жидкости, переносимой лягушке.

С помощью пинцета захватите и приподнимите один лоскут мышцы и фасции. Введите кончик пипетки в разрез и медленно позвольте ооцитам стекать в полость тела. Повторяйте процедуру до тех пор, пока все ооциты не будут перенесены.

Не отпускайте мышечный слой, чтобы предотвратить выпадение ооцитов из разреза. С помощью пинцета захватите оба края разреза и сведите их вместе, позволяя клеткам опуститься в полость тела. Приступайте к наложению швов на мышечный слой и фасцию, как и прежде, стараясь поддерживать натяжение вверх до завязывания первого узла.

Зашейте кожу. Промойте лягушку деионизированной водой и дайте ей прийти в себя, как и раньше. Лягушка должна начать нормально откладывать икру через два-три часа после завершения операции.

Сбор икринок осуществляйте путем обычного сжатия каждые полчаса до тех пор, пока самка не перестанет метать икру, собирая их в чашку. Добавьте четыре миллилитра суспензии свежесобранной спермы в среде XMMR и инкубируйте при комнатной температуре в течение четырех минут. Обильно промойте икры при комнатной температуре.

Первую точку XMMR инкубируют при комнатной температуре для активации и расщепления. Для удаления желеобразных оболочек в любой момент можно использовать цистеин. Перенесенные эмбрионы затем сортируют по отдельным чашкам в зависимости от цвета и культивируют как обычные эмбрионы.

Как правило, более двух третей перенесенных икринок активируются в течение нескольких минут после оплодотворения, демонстрируя выраженное сокращение кортикального слоя на анимальном полюсе. В большинстве экспериментов более половины перенесенных икринок подвергаются нормальному первому делению. Иногда деление может задерживаться примерно на 20 минут по сравнению с икринками реципиента в наших условиях.

От 30 до 60% перенесенных эмбрионов нормально проходят стадию гаструляции и выживают после стадии образования нервной трубки. Перенесенные эмбрионы сохраняют цвет витального красителя на протяжении многих дней развития. Эмбрионы, полученные из неинъецированных контрольных ооцитов, будут выглядеть нормально, как и ожидалось.

Напротив, эмбрионы, полученные из ооцитов, в которые вводили бета-катенин и антисмысловые олигонуклеотиды, например, будут иметь централизованный вид. Мы только что продемонстрировали вам, как получать эмбрионы из ооцитов, подвергнутых манипуляциям в культуре.

При выполнении данной процедуры важно использовать здоровые зрелые ооциты донора и самок-реципиентов с яйцеклетками высокого качества. Кроме того, успех метода обычно коррелирует со скоростью выделения ооцитов и проведения хирургических операций. Поэтому для достижения стабильных результатов может потребоваться определенная практика.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.