Применение Остановлен поток Кинетика методы по расследованию Механизм действия белков репарации ДНК

В данном материале представлены два метода остановленной подачи (stopped-flow) для измерения кинетики реакции белка системы репарации неспаренных оснований ДНК MutS2-MutS6. MutS2-MutS6 распознает неспаренные основания в ДНК и инициирует репарацию в реакции, энергетически обеспечиваемой ATP. Первый метод измеряет связывание MutS2-MutS6 с ДНК по увеличению флуоресценции 2-аминопуринового основания, расположенного рядом с неспаренным основанием GT в ДНК. Реагенты смешиваются в приборе для остановленной подачи, и за процессом ведется наблюдение во времени для определения константы скорости.

Второй метод позволяет измерить активность MutS2-MutS6 ATPase с помощью флуоресцентного репортера на основе фосфат-связывающего белка. Реагенты смешиваются в системе остановленного потока, и за реакцией наблюдают в течение определенного времени. Определение констант скорости гидролиза ATP и высвобождения фосфата на основе полученных кинетических данных позволяет выяснить механизм действия MutS2-MutS6 в процессе репарации ошибочно спаренных оснований ДНК.

Здравствуйте, я Ноа Биро из лаборатории MONI кафедры молекулярной биологии и биохимии Университета Уэслиана. Привет, я ДиДжей Джей, также из лаборатории Мэна в Университете Уэслиана. А я Крис Дсет, также из лаборатории ДжиАй.

Сегодня мы продемонстрируем вам два метода на основе флуоресценции для мониторинга кинетики реакции в миллисекундном временном масштабе. Мы используем эти методы в нашей лаборатории, чтобы изучить, как белок репарации ДНК MutS (MutS-гомолог), MutS6, связывается с ошибочно спаренными основаниями в ДНК и инициирует процесс репарации. Итак, приступим.

Перед началом данной процедуры необходимо подготовить требуемые белковые и ДНК-реагенты. Используйте белок s visier mush two mush six, который был предварительно гиперэкспрессирован в E. coli и очищен методами ионообменной и аффинной хроматографии. Для получения ДНК-реагентов приобретите одноцепочечную ДНК, модифицированную флуоресцентным нуклеотидным аналогом 2-аминопурином; очистите цепи с помощью денатурирующего полиакриламидного гель-электрофореза и отжильте их для создания неспаренных дуплексов ДНК с 2-аминопурином, расположенным рядом с несоответствием GT.

Аналогичным образом приготовьте немеченую ДНК из немодифицированной одноцепочечной ДНК. Последовательности ДНК, используемые в данной работе, приведены в текстовой части этого протокола. На протяжении всей процедуры обеспечивайте высокую достоверность эксперимента, используя высокочистые реагенты для минимизации флуоресцентных примесей.

Также профильтруйте все основные растворы через мембрану с размером пор 0,2 мкм, чтобы удалить частицы, которые могут засорить прибор с остановленным потоком. Для проведения экспериментов по связыванию ДНК подготовьте образцы таким образом, чтобы конечный объем каждого образца составлял 400 µL, что достаточно для получения примерно 10 кинетических кривых. Храните образцы на льду.

Для сохранения активности белка подготовьте образец ДНК в концентрации 0,12 мкМ и образец mush two mush six в концентрации 0,8 мкМ в буфере для связывания ДНК. После смешивания в соотношении один к одному в системе остановленного потока конечные концентрации составят 0,06 мкМ для ДНК и 0,4 мкМ для mush. Two M six.

В приборе с остановленным потоком используется приводной двигатель для одновременного и быстрого вытеснения растворов реагентов из шприцев-дозаторов в смесительное устройство. Затем смешанный раствор поступает в измерительную кювету для сбора данных. Для подготовки прибора сначала убедитесь, что компьютер и контроллер выключены.

Затем включите циркуляционный водяной термостат для охлаждения лампы и зажгите лампу. Установите монохроматор на нужную длину волны возбуждения, которая составляет 315 nanometers. Для 2-аминопурина установите ширину щели SL на требуемое значение.

Установите фильтр с порогом отсечки 350 нм на фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) для регистрации флуоресцентного сигнала двух аминопуринов. Включите контроллер и компьютер. Затем включите циркуляционную водяную баню.

Это заполняет водяную рубашку вокруг приводных шприцев для поддержания требуемой температуры в ходе эксперимента. Наконец, запустите программу остановки потока (stop flow) в меню управления P-M-T-H-V. Установите напряжение ФЭУ (PMT), которое изначально можно варьировать для настройки чувствительности ФЭУ, но которое должно оставаться постоянным.

В ходе эксперимента измерьте темновой ток для коррекции фонового электрического шума. Затем промойте шприцы подачи системы остановленного потока и измерительную кювету. Установите клапан загрузки образца в положение загрузки.

Наберите в шприц объемом 1 мл деионизированную фильтрованную воду. Подсоедините шприц к загрузочному порту, расположенному под приводным шприцем, и пропустите воду между двумя шприцами. Повторите эту процедуру дважды для каждого из них.

Приводной шприц, который будет использоваться в эксперименте. Затем заполните приводные шприцы водой для промывки кюветы. Переведите клапан загрузки образца в рабочее положение.

Используйте команду регулировки привода шприца, чтобы опустить приводную пластину и протолкнуть воду через наблюдательную кювету в выходную линию. Следите за тем, чтобы не доводить поршень до самого конца приводного шприца. В завершение поднимите приводную пластину и переведите клапан в положение загрузки.

Однократно промойте систему реакционным буфером и опорожните шприцы. Для начала экспериментов по связыванию ДНК перенесите каждый образец из пробирки в новый шприц объемом один миллилитр. Подсоедините каждый шприц к загрузочному порту и введите раствор в приводной шприц.

Удалите все пузырьки воздуха, перемещая раствор между двумя шприцами вручную с периодическими паузами. Затем опустите приводную пластину до соприкосновения с верхней частью приводных шприцев. Для сбора данных откройте окно настройки временных каналов.

Выберите режим канала сбора данных для анализа и количество собираемых трасс. Введите время сбора данных, в течение которого будет собрано 1000 точек данных. Затем установите клапан в рабочее положение и нажмите кнопку сбора данных.

Это действие инициирует смешивание смеси два, смеси шесть и ДНК, после чего реакционная смесь поступает в зону наблюдения. Флуоресцентное излучение клеток от 2-аминопурина контролируется на протяжении всего процесса. Соберите не менее пяти кинетических кривых для получения высококачественного набора данных и сохраните файл по завершении эксперимента.

Откройте каждый файл данных и вычислите среднее значение для нескольких кинетических кривых. Затем сохраните файл со средними данными и экспортируйте его в программу для построения графиков с целью анализа. В завершение выключите лампу, тщательно промойте шприцы и кювету водой.

Затем выключите остальное оборудование, кроме циркуляционного водяного термостата. Его следует оставить включенным еще на 15 минут для охлаждения лампы. Кинетические данные связывания Msh2-Msh6 с некомплементарной ДНК лучше всего описываются одной экспоненциальной функцией, которая дает высокую скорость ассоциации порядка 10⁷ M⁻¹s⁻¹; аналогичные эксперименты с остановкой потока позволяют определить скорость диссоциации комплекса Msh2-Msh6 с некомплементарной ДНК, которая протекает очень медленно, со значением 0,01–0,02 s⁻¹.

Эти результаты позволяют напрямую измерить скорость и сродство, с которыми комплекс MutS2-MutS6 связывает несоответствующую пару оснований в ходе реакции репарации ДНК. Далее будет проведен эксперимент с использованием метода остановленного потока для измерения АТФазной активности MutS2-MutS6.

В условиях предстационарного состояния для данного анализа крайне важно избегать использования стекла на всех этапах подготовки реагентов, включая очистку белков и ДНК, чтобы минимизировать фоновые уровни фосфата. В качестве репортера для измерения высвобождения фосфата после гидролиза TP используется фосфат-связывающий белок (PBP), очищенный из e coli и меченный флуорофором MDCC. M-D-C-C-P-B-P является надежным репортером кинетики гидролиза ATP и высвобождения фосфата в предстационарном состоянии. Он быстро и с высоким сродством связывает свободный фосфат, что приводит к значительному увеличению флуоресценции MDCC.

Подготовьте образец, содержащий 4 µM mush и 2 mush six protein, с добавлением или без добавления 6 µM некомплементарной ДНК. Подготовьте другой образец, содержащий 1 mM свежерастворенного HEP и 20 µM M-D-C-C-P-V-P для удаления любых contaminating phosphate. Добавьте в образцы пурин-нуклеозид-фосфорилазу и 7-метилгуанин, затем инкубируйте на льду не менее 20 минут.

Подготовьте прибор для метода остановленной струи (stopped-flow), как описано ранее. Кроме того, удалите любые остатки фосфатных загрязнений из приводных шприцев с помощью пуринов, нуклеозидов, фосфорильных групп и семиметилгуанина. Инкубируйте в течение 20 минут. Установите длину волны возбуждения на 425 нанометров и используйте отсекающий фильтр 450 нанометров с ФЭУ для детектирования флуоресценции M-D-C-C-P-B-P.

Заполните шприцы подачи образцами, как было описано ранее. Установите параметры сбора данных и нажмите «collect data», чтобы смешать mush two mush six с TP и M-D-C-C-P-B-P; контролируйте высвобождение фосфата по mush two mush six и сопутствующее увеличение флуоресценции M-D-C-C-P-P-P с течением времени. Соберите не менее пяти кинетических кривых для получения набора данных высокого качества и сохраните файл; усредните несколько кинетических кривых и экспортируйте файл с данными для анализа, как было описано ранее. Подготовьте калибровочную кривую для определения линейной зависимости между концентрацией фосфата и флуоресценцией M-D-C-C-P-P-P: сначала смешайте M-D-C-C-P-P-P с различными концентрациями фосфата в системе остановленного потока при тех же экспериментальных условиях.

Затем постройте калибровочную кривую зависимости максимальной флуоресценции M-D-C-C-P-P-P от каждой концентрации фосфата и используйте наклон этой кривой для определения концентрации фосфата в реакциях с Mush2-Mush6. Постройте график зависимости концентрации фосфата от времени и аппроксимируйте данные с помощью экспоненциальной и линейной функций. Эта функция описывает всплеск гидролиза ATP и высвобождения фосфата в предстационарном состоянии с последующей линейной стационарной фазой реакции. Кинетические данные показывают, что Mush2-Mush6 гидролизует ATP и быстро высвобождает фосфат со скоростью 1,4 с⁻¹ в течение первого каталитического цикла.

За этим следует медленная стадия реакции, которая ограничивает последующие обороты, снижая стационарную каталитическую константу в семь раз до 0,2 в секунду. Однако при связывании MutS2-MutS6 с некомплементарной ДНК всплеск гидролиза ATP и высвобождения фосфата подавляется. Эти результаты напрямую показывают, что при связывании с некомплементарной базовой парой и ДНК комплекс MutS2-MutS6 переходит в состояние, связанное с ATP.

Этот переход является критическим этапом реакции репарации ДНК. Мы только что продемонстрировали вам, как использовать прибор для остановленного потока для измерения кинетики реакции в реальном времени. Такие измерения расширили наше понимание механизма действия MASH two, MASH six и репарации неспаренных оснований ДНК.

При проведении экспериментов такого типа важно использовать высококачественные реагенты, включая высокоочищенные ДНК и белки, а также уделять особое внимание предотвращению фосфатного загрязнения при проведении анализа АТФ. На этом всё. Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.