Оптическая микроскопия Scatter на основе двумерных фильтров Габора

В этом видео оптическая рассеянная микроскопия используется для количественной оценки фрагментации митохондрий во время апоптоза. Несмотря на то, что оптическая рассеянная микроскопия обычно не требует флуоресценции в этом протоколе, флуоресцентные изображения будут получены в целях валидации. После настройки системы визуализации клетки помечаются зеленым трекером MIT и обрабатываются спорином стори, чтобы вызвать апоптоз.

Оптические данные собираются для обнаружения изменений в ориентации клеточных органелл в течение двух часов. Начало фрагментации митохондрий можно измерить с помощью оптических рассеянных данных, которые показывают снижение степени ориентации субклеточных частиц. Затем данные проверяются путем сопоставления оптических рассеянных данных с флуоресцентными областями, содержащими митохондрии.

Здравствуйте, меня зовут Нада Бустани из лаборатории биооптики факультета биомедицинской инженерии Университета Рутгерса. Я Роб Пак из Bio Optics Lab, и я также Дин из Bio Lab. Сегодня мы покажем вам процедуру количественной оценки субклеточной морфологической динамики с помощью метода, который не опирается на флуоресцентные красители.

Мы используем эту технику в нашей лаборатории для изучения динамических изменений в субклеточной структуре во время апоптоза или программирования гибели клеток. Итак, приступим. Начните эту процедуру со стерилизации рук в перчатках 70% этанолом.

Затем поместите приготовленный 100 наномолярный стоковый раствор зеленого miot tracker зеленого и предварительно подогрейте среду для клеточной культуры BAEC в колпак при выключенном свете и простерилизуйте все поверхности. Далее поместите под колпак шестилуночную чашку для культуры с ячейками, расположенными на покровном стекле. С помощью пастообразной пипетки, подключенной к вакуумной линии.

Удалите клеточную среду из лунок. Затем сразу же добавьте по два миллилитра меченой среды в каждую лунку для мечения клеток. Митохондрии. Накройте планшет для культивирования тканей, чтобы предотвратить попадание прямого света в помещение, и быстро поместите клетки обратно в инкубатор.

Инкубируйте в течение 45 минут при температуре 37 градусов Цельсия, пока клетки инкубируются. Подготовьте оптическую установку, сначала включите зажим ртутной дуги. Затем включите компьютер с микроскопом камер и лазерным штекером в цифровое микрозеркальное устройство или DMD во вращающемся диффузоре.

Затем посмотрите в окуляр микроскопа, чтобы увидеть, выровнен ли оптический запуск. Поле зрения должно быть ярко освещено лазерным светом. Чтобы загрузить образец, нанесите одну-две небольшие капли иммерсионного масла на объектив для погружения в 63 раза, пока он полностью опустится.

Затем на сцену устанавливают предметное стекло, состоящее из сетки линий с регулярными интервалами в 10 микрометров, называемые гради, и поднимают объектив так, чтобы масло захватывало его фокус. Далее сфокусируйтесь на шестиугольном крае поля конденсатора. Остановитесь, чтобы он был выровнен по центральному освещению Kohler.

Шестиугольный край должен быть отцентрирован в окуляре и четко сфокусирован. Затем с помощью ручек положения положения положения конденсорного поля, конденсорного поля, остановите над полем зрения. Запустите лабораторию IP и введите настройки для работы с камерой.

Убедитесь, что фотокамера установлена в режим передачи кадров. Выполните команду захвата фокуса, чтобы начать предварительный просмотр в реальном времени. Затем установите префикс индекса и расположение файла, в который будут сохраняться изображения.

Далее инициируем создание образа RS. Назначьте настройки для работы с камерой Cool Snap. Режим синхронизации должен быть установлен в нормальном режиме.

Запустите программное обеспечение DMD. Поместите ирисовую оболочку темного поля в меню скрипта. Затем нажмите на «Загрузить» и «Сбросить».

Для запуска скрипта вручную установите полосу optiv для микроскопа во вьюпорте в положение LSM. Это приведет к отправке изображения через DMD в выровненную оптику. Проецирование изображения темного поля на ПЗС-матрицу камеры Cascade five 12.

Изображение темного поля должно появиться на предварительном просмотре в режиме реального времени в лаборатории IP. При необходимости сфокусируйте изображение на предварительном просмотре в реальном времени. Установите время экспозиции, достаточное для того, чтобы обеспечить не менее 10 000 отсчетов сигнала на изображении.

Затем сделайте снимок поля зрения с помощью команды Gain single после захвата. Используйте команду Сохранить как индексированный, чтобы сохранить изображение на диск. Изображение GTI измеряет размер поля зрения.

Теперь переместите образец GTI так, чтобы он оказался за пределами поля зрения и был виден только фон. Сделайте фоновое изображение поля с выдержкой, достаточной для получения не менее 5 000 счетов. Это изображение поможет в вычитании фона из неотфильтрованных изображений.

Теперь для получения отфильтрованных изображений фона Gabor загрузите скрипт Gabor Filter Bank в управляющее программное обеспечение DMD. Запустите весь скрипт для буферизации фильтров во встроенной памяти DMD. Это может занять несколько минут после того, как весь скрипт будет буферизован.

Используйте маркеры запуска и остановки в программном обеспечении DMD, чтобы убедиться, что за один раз загружается только один набор фильтров, соответствующий одному фильтру Gabor Like. Запустите скрипт для получения отфильтрованных изображений фона. Предварительный просмотр изображения в реальном времени должен измениться с темного поля на отфильтрованное изображение.

Для этого фильтра откройте скрипт сбора данных в IP lab с диска. Отрегулируйте время экспозиции, чтобы убедиться, что собрано не менее 2000 отсчетов. Во время выполнения сценария DMD отмените предварительную версию в режиме реального времени в лаборатории IP и запустите сценарий сбора.

Это автоматически приведет к получению индекса и сохранению отфильтрованного изображения на диск. После получения первого изображения остановите выполнение скрипта в DMD. Удалите используемые команды из скрипта.

Затем замените маркеры начала и остановки в начале и в конце следующего набора фильтров. Повторяйте сбор данных в лаборатории IP до тех пор, пока не будет использован весь банк фильтров, а все отфильтрованные изображения не будут получены и сохранены. Подготовьтесь к нанесению покрытия на ячейки, подключив паяльник на лабораторном столе и нагрев L 15 medium до 37 градусов Цельсия.

Сделайте рабочее место с бумажным полотенцем и салфеткой Кима, чтобы впитать любую пролитую среду и сохранить область в чистоте. Подготовьте несколько фитилей, разорвав и покрутив салфетки кимм. Фитили будут использоваться для прокачивания жидкости через клеточную пластину.

Затем используйте металлический держатель для образцов, чтобы создать сэндвич с клетками. С помощью шприца нанесите тонкую капельку вакуумной смазки по верхней периферии отверстия в обработанной металлической пластине, простираясь примерно на полпути к концам канавок с каждой стороны. Аккуратно нанесите на смазку чистый чехол номер один.

Переверните пластину и нанесите смазку вокруг отверстия. Выключите свет в комнате в перчатках для пробного осмотра, стерилизованных этанолом. Достаньте клетки из инкубатора.

Снимите крышку, которая будет использоваться для эксперимента, с шестилуночной пластины. Тщательно высушите покровную крышку. Затем вдавите защитную ячейку стороной вниз в смазанную маслом металлическую пластину над смотровым отверстием.

Сэндвич ячеек внутри тарелки. Убедитесь, что не осталось воздушных зазоров и что смазка образовала водонепроницаемое уплотнение, позволяющее загружать среду. Теперь переверните пластину обратно над пипетированием по 200 микролитров за раз.

Добавьте предварительно подогретый L 15 medium в бутерброд через паз между верхней крышкой и металлической пластиной, пока жидкость почти не достигнет канавки с другой стороны. Далее промойте клетки, держа фитиль в противоположной канавке и впрыскав в бутерброд еще 200 микролитров среды. Среда будет перетекать с одной стороны на другую, когда фитиль удаляет старую среду.

Будьте осторожны, чтобы во время этого шага в жидкости не образовались пузырьки. Повторите этот процесс два-три раза, используя новый фитиль для каждого полоскания. Теперь еще раз переверните пластину, поддерживая пластину с краев, чтобы жидкость задерживалась в резервуаре ячейки.

Опустите паяльник в стакан, чтобы быстро расплавить часть паяльника, которая затем будет цепляться за жало паяльника. С помощью жала паяльника аккуратно нанесите линяющую венку по краям нижнего покровного накладки. Продолжайте окунать и наносить по всему периметру защитного стекла, приклеивая его к металлической пластине.

Это создает хорошее механическое уплотнение, поэтому защитное стекло не будет отделяться от пластины при просмотре. Очистите дно от остатков. Защитите поверхность скольжения, протерев салфетку и очистив крышку.

Скользите одним скользящим движением, чтобы убедиться, что крышка наиболее чиста в центре, где она будет видна. Верните шестистенную пластину в инкубатор. Отнесите пластинчатые элементы в оптическую лабораторию и установите их на объектив.

Как и раньше, найдите поле здоровых клеток и получите изображение темного поля зрения. Затем настройте микроскоп в режим DIC, убедившись, что время экспозиции достаточное. Получение изображения DIC с помощью каскадной камеры.

В этой конфигурации флуоресцентные изображения получаются с помощью крутой камеры SNAP, в то время как микроскоп все еще выровнен по DIC. Установите VAR микроскопа на один x и вьюпорт на 100% бинокль и отведите изображение от окуляра к камере. Поместите синий светодиод над конденсатором, чтобы осветить поле.

Затем просмотрите поле зрения в RSS-изображении и настройте тонкую фокусировку. При необходимости получите образ DIC и сохраните его на диск. Обратите внимание, как поле зрения отличается от того, которое получается от каскадной камеры.

Эти изображения должны быть зарегистрированы на этапе анализа эксперимента. Затем переместите куб флуоресцентного фильтра в нужное положение и получите флуоресцентное изображение, кратковременно включив возбуждение флуоресценции с помощью затвора микроскопа, а затем выключите его, как только сбор данных будет завершен. Чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание, сохраните флуоресцентное изображение на диске.

Чтобы получить отфильтрованные изображения, переведите микроскоп в полевое положение и направьте свет через порт LSM. Как и раньше, запустите весь скрипт банка фильтров Габора, как и раньше, чтобы завершить сбор данных для одной временной точки, пока ячейки все еще находятся на сцене и не нарушают поле зрения. Используйте метод впитывания, чтобы заменить обычную среду L 15 на такую же, содержащую один микромолярный раствор STS.

В ходе эксперимента добавляйте дополнительную среду для предотвращения высыхания, пипетируя среду в канавку клеточной пластины, не снимая ее со сцены и не нарушая поле зрения. Теперь повторяйте эти шаги для последующих временных точек, пока эксперимент не будет завершен. Собранные данные будут включать в себя большое количество отфильтрованных изображений, которые необходимо обработать для извлечения данных о субклеточной структуре.

Здесь показаны два примера экспериментов. На этом рисунке показаны последовательные изображения образца морских диатомовых водорослей. Ориентированные особенности хорошо видны.

В темном поле визуализации. Оптически отфильтрованные изображения, помеченные пятью равными нулю градусов и пятью, равными 160 градусам, отображаются рядом с нефильтрованным изображением образца. Для сравнения, набор из девяти отфильтрованных по методу Габора изображений диатомовых водорослей был обработан пиксель за пикселем для ориентации объекта.

В каждом пикселе максимальный сигнал был разделен на средний сигнал в зависимости от ориентации фильтра, чтобы получить значение соотношения сторон. Здесь соотношение сторон, близкое к обозначенному синим цветом, присутствует в областях, в которых нет предпочтительного угла отклика. Более высокие значения, обозначенные красным цветом, указывают на области, в которых присутствует более высокий предпочтительный угловой отклик.

Яркость и кодовая значимость общего отклика фильтра GABOR, ориентация фильтра, дающая максимальный сигнал на каждом пикселе, соответствуют направлению, перпендикулярному ориентации нижележащего объекта. Ориентация подструктурных частиц закодирована в виде колчанного графика, где каждая линия точно согласуется с базовой локальной ориентацией объекта, видимой в нефильтрованном темном поле. Колчанный график показывает ориентацию объектов с интенсивностью отклика более 10% от максимальной.

Эти темные поля и оптически отфильтрованные изображения поля содержали живые эндотелиальные клетки крупного рогатого скота, отфильтрованные изображения впоследствии получались каждые 20 минут в течение трех часов после обработки спорином индуктора апоптоза. Здесь карта соотношения сторон на верхней панели и флуоресцентная визуализация митохондрий на нижней панели показаны в зависимости от времени. Цветовой оттенок представляет степень ориентации, так как до того, как эти временные графики сравнивали уменьшение степени ориентации аспектного отношения частиц в эндотелиальных клетках, обработанных storosporin, отдельные следы представляют временные графики внутри отдельных клеток.

Ориентация на падение ограничена областями клеток, которые регистрируются флуоресцентными областями. Теперь была проведена валидация на флуоресценцию. Он становится архивным.

Таким образом, в следующих экспериментах митохондриальные измерения могут быть выполнены, если пропустить этапы флуоресцентной визуализации и непосредственно использовать метод оптического рассеяния. Мы только что показали вам, как контролировать фрагментацию митохондрий во время апоптоза с помощью сигнатур светорассеяния на основе фильтров Габора. При выполнении этой процедуры важно хорошо подготовиться к образу жизни и убедиться, что оптическая установка хорошо выровнена и откалибрована.

Так что давайте возьмем смысл для наблюдения и CoLab с экспериментами с пользовательским интерфейсом.