Трансплантация GFP-экспрессирующих бластомеров для живых изображений сетчатки и мозга развития в химерические эмбрионов данио рерио

Блэр — это эмбриональные клетки, образующиеся на стадии расщепления. Здесь меченые GFP Blairs переводятся от одного эмбриона данио-рерио к другому с помощью трансплантационной иглы. Этот метод позволяет проследить поведение и судьбу богохульников с измененным генетическим фоном на нормальном эмбрионе или наоборот с помощью микроскопической визуализации в реальном времени.

Здравствуйте, я доктор Зоран, лаборатория доктора Шоу на кафедре офтальмологии Университета Питтсбурга. Сегодня мы покажем вам процедуру транспортировки груди у рыбок данио-рерио. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения сетчатки глаза и развития мозга.

Итак, приступим. Вечером установите попарные скрещивания данио-рерио, чтобы предотвратить случайное спаривание. До нужного времени используйте разделители, чтобы отделить самок и самцов рыб. Здесь.

GFP, экспрессирующие трансгенные рыбы, используются в качестве источника донорских бластомеров. Трансгенная линия PT 1 0 4 экспрессирует GFP повсеместно под контролем одного промоутера EF для подготовки агрос лунок, которые будут удерживать эмбрионы, заливать растопленный 1% агрос, приготовленный в Е тремя яйцами воды, в чашку Петри. Всплыть пластиковую форму с клиновидными выступами на растворе агроса.

Затем дайте ему остыть. Чтобы тщательно застыть, снимите плесень и погрузите грядку в воду Е три. Далее подготавливают иглы для пересадки.

Используйте вертикальный съемник игл при настройке мощности 11,5 для извлечения стеклянных капиллярных пипеток. Хорошие кончики игл должны сужаться с длинными стержнями. Шлифуйте кончики игл под углом 45 градусов с помощью микрошлифовальной машины до получения скошенных отверстий от 30 до 40 микрометров по внутреннему диаметру.

Чтобы очистить кончики игл, прикрепите шланг к тупому концу, подсоедините шланг к шприцу, а затем всасывайте и выпускайте 10% раствор фтористоводородной кислоты. До тех пор, пока не будет удален весь видимый мусор. Промойте кончики дистиллированной водой.

Затем со 100% этанолом высушите иголки на воздухе, пока весь этанол не испарится. Важно следить за тем, чтобы кончики были полностью сухими. Остаточный этанол испортит иглы во время высокотемпературной полировки.

Шаг второй: чтобы смягчить и отполировать шероховатые края кончиков игл, запекайте их с помощью тепла, выделяемого нитью микрофальцевального станка. Не допускайте соприкосновения кончиков игл с нитью во время полировки количества электричества, проходящего через нить, и расстояния между нитью и иглой. Наконечники можно отрегулировать для достижения желаемых условий нагрева.

Температура не должна быть слишком высокой. Это расплавит и деформирует кончики игл после того, как шероховатые края будут сглажены. Осторожно коснитесь нагретой нити кончиком иглы, а затем осторожно потяните нить в сторону, чтобы получился заостренный конец.

Острая, гладкая и чистая игла имеет решающее значение для получения неповрежденных донорских бластеров без повреждения эмбрионов-хозяев. Натяните стеклянную пипетку на газовое пламя, чтобы получился тонкий стеклянный щуп со сглаженным концом. Этот зонд будет использоваться для позиционирования эмбрионов в правильной ориентации перед трансплантацией.

В день эксперимента снимите разделители в поперечных кассетах, чтобы дать возможность рыбам спариваться. Восемь. Через 30 минут соберите от 100 до 200 эмбрионов, высыпав их в сетку. Поместите эмбрионы в чашку Петри, наполненную водой Е-три.

Затем с помощью тонких щипцов удалите оболочку эмбрионов, вручную оторвав COR. Затем с помощью стеклянной пипетки с загнутым стержнем аккуратно перенесите покрытые оболочкой эмбрионы в арос-лунки. Не допускайте контакта эмбрионов с воздухом, что приведет к их разрыву.

Дайте эмбрионам развиваться при температуре 28,5 градусов Цельсия в лунках ароса в течение трех часов после оплодотворения или HPF, пока эмбрионы развиваются. Настройте аппарат для трансплантации, подключив трансплантационную иглу к заполненной минеральным маслом микронасосной системе. Следите за тем, чтобы система не протекала и в ней не было захваченных пузырьков воздуха.

Заполните всю иглу для трансплантации минеральным маслом, за исключением пространства от 0,5 до одного микролитра в отверстии кончика. Извлеките эмбрионы из инкубатора и поместите их на столик микроскопа, чтобы пересадить богохульство. Используйте стеклянный позиционирующий зонд, чтобы ориентировать богохульную сторону трех-четырех эмбрионов HPF вверх.

Затем аккуратно введите трансплантационную иглу в донорский эмбрион и медленно всасывайте в иглу от пяти до 20 богохульства, следя за тем, чтобы кончик иглы не соприкасался с воздухом во время пересадки. Вставьте наполненную богохульством иглу в эмбрион хозяина и медленно отпустите богохульство. Место, в котором богохульники будут выпущены, будет влиять на то, где локализуется их потомство на более поздних стадиях развития для анализа развития сетчатки и мозга, высвобождающих клеток на полюсе животного.

Если необходимо проанализировать развитие других тканей и органов, то соответственно следует рассмотреть различные места высвобождения. Чтобы свести к минимуму механические повреждения во время трансплантации, эмбрионы хозяина оставляют в агролунках при температуре 28,5 градусов Цельсия до следующего дня. Затем переложите мозаичные зародыши в 24 луночные чашки, предварительно покрытые 0,5 миллилитрами 1%ароса и заполненные одним миллилитром Е трех яиц воды.

В каждую лунку следует добавить по одному эмбриону для профилактики бактериальных инфекций по 10 микролитров 100 х пенициллина и стрептомицина. Для каждого хорошо отвесьте и приготовьте низкую температуру плавления или LMP aros и выдержите раствор на водяной бане при температуре 30 градусов Цельсия. Перенесите мозаичный зародыш в блюдо для флоры со стеклянным дном толщиной 0,17 миллиметра.

Удалите излишки воды из трех вод, чтобы оставить эмбрион просто покрытым. Затем при 30-50 микролитрах расплавляется 1,5%-ная ЛМП к зародышу быстро, пока раствор ARO не застынет. Расположите глаз или мозг как можно ближе к стеклянному дну.

После того как раствор остынет, добавьте дополнительный раствор агроса, чтобы еще больше закрепить эмбрионы на месте. Погрузите застывший блок агроса в два-три миллилитра Е трех яиц воды для конфокальной микроскопии. Используется перевернутый объектив с 40-кратным погружением в воду и большой глубиной фокусировки.

Добавьте каплю воды на объектив и поставьте на сцену чашку для культивирования тканей флоры и сфокусируйтесь для развития изображения. Выполняйте покадровую съемку, делая снимки эмбрионов каждые пять минут. В зависимости от характера экспериментов временные интервалы между выстрелами могут корректироваться.

Здесь показано репрезентативное изображение рыбы 24 HPF seber. Экспрессия GFP выделяет донорские клетки зеленым цветом. Нейроэпителиальные клетки сетчатки охватывают всю толщину стенки сетчатки.

В этом фильме показаны движения донорских клеток в мозге хозяина при 24 HPF. Обратите внимание, что морфология клеток меняется со временем. Просто покажите вам, как выполнять транспортировку нагрудного зеркала у рыбок данио.

При выполнении этой процедуры важно не забывать аккуратно подготавливать хорошую иглу к области пересаженной груди. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте.