Ткань Определение Использование трансплантации животных Cap (ACT) в Пробирной Xenopus laevis

Общая цель КТ-анализа А состоит в том, чтобы проверить, может ли ген или гены, представляющие интерес, указывать примитивную дерму на судьбу конкретной клетки. Процедура начинается с экспрессии РНК в кодировании гена флуоресцентного репортера и гена или генов, представляющих интерес для развития эмбрионов XUS lavis. Следующим шагом является препарирование животной крышки или примитивного одума, экспрессирующего сверхэкспрессированные РНК, и выращивание их до стадии 15.

Третьим этапом процедуры является удаление ткани на боковой стороне эмбриона хозяина 15 стадии. Последним шагом является пересадка половины ткани донорского животного на фланг эмбриона-хозяина и выращивание хозяина до стадии 42-43. Результаты показывают образование эктопических тканей, таких как структуры, похожие на глаза, путем разрезания и иммуноокрашивания на тканеспецифические маркеры.

Здравствуйте, я работаю на кафедре офтальмологии в Медицинском университете штата Калифорния. Сегодня я покажу вам процедуру, которую мы называем анализом трансплантации животного колпачка, который я разработал в сотрудничестве с Майком Сабером. Мы используем этот анализ в обеих наших лабораториях для изучения генов, достаточных для формирования глаза.

Итак, приступим. Чтобы начать эту процедуру, подготовьте РНК cap для инъекции, транскрибируйте ноггин или другой интересующий ген и YFP для использования в качестве индикатора. Также приготовьте растворы на основе MMR, запас раствора для кладки яиц из восьми штук и иглы для инъекций эмбрионов.

Изготовленная на заказ эластомерная форма используется для изготовления посуды для хранения эмбрионов. Создание одной инжекторной пластины в каждом экспериментальном условиях путем расплавления 1% AROS в 0,4 XMMR в микроволновой печи. Перелейте около шести миллилитров раствора в 60-миллиметровую пластину.

Аккуратно поместите эластомерную форму поверх раствора, чтобы предотвратить образование пузырей, и дайте остыть около 20 минут. При комнатной температуре создайте одну изоляционную пластину для колпачка для каждого экспериментального условия, используя 1%AGROS плюс 0,7 XMMR с пресс-формами, как было показано только что для пластин для литья под давлением. Подготовьте дополнительные тарелки для каждого временного момента.

Обратитесь к прилагаемому письменному протоколу для получения подробной информации о подсчете временных точек. Далее изолируем. Протестируйте их на самце лягушки и храните ткань при температуре четыре градуса Цельсия в стерильном растворе одного XMMR с добавлением 50 микрограммов гентамицина на миллилитр.

Это можно сделать за неделю до начала эксперимента, но учтите, что сперматозоиды со временем теряют свою эффективность, в конце дня за день до микроинъекции. Введите женщинам 500 единиц хорионического гонадотропина человека. Поместите самок при температуре от 16 до 18 градусов Цельсия на ночь.

Теперь все готово для микроинъекции на следующий день. Начните с удаления гормонально индуцированных самок и поместите их в отдельные резервуары, содержащие один XELS. Подготовьте иглу к микроинъекции, отрезав кончик.

Чтобы получить иглу диаметром от 25 до 35 микрометров, поместите иглу на пико-инъектор PLI 100 и откалибруйте его так, чтобы она выдавала 10 нанолитров за инъекцию. Установите инкубатор на 14 градусов по Цельсию, поставив на выходе эту более низкую температуру, после введения в них РНК, развитие эмбриона замедлится и можно провести еще много пересадок за один эксперимент примерно за час до оплодотворения, извлечь яйцеклетки из емкости. После того, как самки отложили яйца в течение дополнительного часа, используйте передаточную пипетку, чтобы извлечь только что отложенные яйца из аквариума.

Обратите внимание, что не следует использовать яйца, которые находились в растворе ELS более двух часов. По мере снижения качества яиц поместите яйца в 60-миллиметровые петротарные чашки. Блюдо примерно на 80% состоит из одного слоя яиц.

Удалите как можно больше ELS из яиц и замените его одним XMMR. Яйца могут оставаться в одном XMMR до часа. Далее in vitro оплодотворяют яйцеклетки гомогенизированными семенниками.

Лучше всего оплодотворять эмбрионы тремя отдельными партиями около 11:00 утра и 13:00 вечера, чтобы они могли вырасти до желаемой стадии. От 8,5 до 9 для изоляции шапок и стадия 15 для трансплантации. Через час после оплодотворения яйцеклеток удалите желейную оболочку на яйцах с помощью D jelly Solution Wash с обильным количеством 0,1 XMMR, а затем подождите, пока оплодотворенные яйцеклетки достигнут двухклеточной стадии.

Чтобы начать сортировку. Приготовьте чашку для инъекций, наполненную 0,4 XMMR плюс 6% F ccal. Как только эмбрионы достигнут двухклеточной стадии, используйте трансферную пипетку, чтобы отсортировать равномерно пигментированные и равномерно делящиеся эмбрионы в лунку чашки для инъекций.

Приступайте к микроинъектированию, сначала растяните перфил над верхней частью 60-миллиметровой крышки петрочашки. Пипетируйте два микролитра образца РНК на биопленку и аспиратуйте. Использование пико-инъектора для заполнения инъекционной иглы.

Перед началом инъекции обязательно убедитесь, что игла все еще выдает 10 литров образца. РНК вводится в оба бластера на двух клеточных стадиях эмбриона. Введите от 20 до 30 эмбрионов по 500 пикограммов Y-F-P-R-N-A и поместите в одну чашку.

Введите еще от 20 до 30 эмбрионов по 20 пикограммов Nain, РНК, предварительно смешанной с Y-F-P-R-N-A, и поместите в чашку. Кроме того, помещайте от 100 до 200 инъекционных эмбрионов в другой чашке для инъекций, содержащей раствор FICO. Перемещайте эти эмбрионы в инкубатор и из него одновременно с введенными эмбрионами.

Именно эти хосты будут использоваться для пересадки колпачков после инъекции. Инкубируйте все эмбрионы при температуре 14 градусов Цельсия в течение ночи. Повторите для всех запланированных временных точек.

После ночной инкубации шапочку животного можно изолировать. Приезжайте рано утром, чтобы определить стадию эмбрионов. Не забудьте также извлечь из инкубатора инъекционные эмбрионы хозяина.

Самая ранняя временная точка должна быть на девятом этапе. Во-первых, удалите эмбрионы, которые не выжили. Приступайте к выделению колпачков животных из жизнеспособных эмбрионов, работая с каждым моментом времени в партиях с чашкой для изоляции колпачков.

Добавьте большое количество 0,7 XMMR плюс раствор гентамицина. Затем слейте раствор фола с каждой пластины, содержащей введенные эмбрионы, и добавьте обратно 0,7 XMMR плюс раствор гентамицина. Извлеките эмбрионы из лунок для инъекций с помощью передаточной пипетки и поместите в только что приготовленную чашку для изоляции колпачков.

Используйте либо гастромастер с желтым наконечником, изогнутым до 400 микрометров, либо пару острых щипцов номер пять, чтобы изолировать колпачки животных в 0,7 XMMR плюс раствор гентамицина. Оставьте два или три неповрежденных эмбриона для стадии. После изоляции колпачков животных поместите их обратно в инкубатор при температуре 14 градусов Цельсия вместе с эмбрионами-хозяевами до следующего дня, когда колпачки будут пересажены на бок эмбрионов-хозяев.

Удалите колпачки и эмбрионы хозяина из первой временной точки из инкубатора при температуре 14 градусов Цельсия и отсортируйте эмбрионы для получения однородных флуоресцентных положительных колпачков. Подсчитайте количество колпачков и удалите их. Увеличьте вдвое количество эмбрионов хозяина до только что приготовленной инъекционной чашки с помощью 0,7 XMMR плюс раствор гентамицина с острыми щипцами номер пять.

Удалите оболочку Lene у каждого эмбриона хозяина. Переложите их на тарелку вместе с крышками, но будьте осторожны без их линзовых мембран. Эмбрионы могут быстро диссоциировать на поверхности воды с помощью гастромастера, оснащенного желтым наконечником с изогнутой проволокой от 200 до 250 микрометров на самой высокой настройке, или с помощью щипцов номер пять.

Удалите квадрат размером 200 микрометров на боковой стороне эмбриона на стадии с 14 по 15 стадию. Затем снова с помощью гастромастера или щипцов номер пять. Разрежьте колпачок пополам и поместите ткань в отверстие, сделанное в эмбрионе хозяина.

Поверните эмбрион против лунки, чтобы обеспечить заживление. Сделайте это для как можно большего количества эмбрионов, пока они находятся на стадии 15. Повторите для всех временных точек.

Эмбрион обычно заживает в течение 30 минут. А с помощью щипцов номер пять удалите омертвевшие клетки, которые кажутся белыми, мягкими движениями щеткой. Выращивайте пересаженные эмбрионы при температуре 18 градусов Цельсия в течение ночи.

После ночной инкубации работайте под препарирующим флуоресцентным микроскопом, чтобы отсортировать эмбрионы с флуоресцентно меченой трансплантированной тканью. Поместите выбранные эмбрионы обратно при температуре 18 градусов Цельсия, чтобы они росли до стадии с 42 по 43. Когда животные достигнут нужной стадии, сделайте им анестезию в трику и осмотрите под флуоресцентным препарирующим микроскопом и сделайте снимки.

Затем трансплантированные эмбрионы могут быть зафиксированы, разделены и иммуноокрашены, или можно выполнить гибридизацию in situ с использованием маркеров для представляющей интерес ткани. Вот репрезентативные результаты головастика хозяина с донорской тканью, экспрессирующей флуоресцентный индикатор и ноггин через день после трансплантации. Обратите внимание, как ткань сворачивается вверх на боковой стороне головастика.

Эмбрионы-хозяева, получающие контролируемую донорскую ткань, экспрессирующую только флуоресцентный индикатор, уже начинают встраивать клетки животного капа на свой бок. Через несколько дней головастики, получающие донорские клетки, экспрессирующие наин, образуют структуры, похожие на глаза, в то время как головастики, получающие контрольную донорскую ткань, имеют флуоресцентные клетки на поверхности кожи. Мы только что показали вам, как провести анализ на пересадку колпачка животного в Zaps Lavis.

При проведении этого анализа. Важно помнить, что все должно быть готово до этого дня процедуры, чтобы эмбрионы не развивались быстрее, чем вы сможете до них добраться. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.