Name: Ткань Определение Использование трансплантации животных Cap (ACT) в Пробирной Xenopus laevis /em (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Изучите метод трансплантации животных шапочек в Xenopus laevis для определения судьбы тканей при развитии эмбрионов. Этот подход позволяет исследовать влияние генов на формирование клеточных типов.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была поддержана грантами от исследований в области профилактики слепоты (по развитию карьеры награждения МЭЗ и АСВ и неограниченный предоставляют отделения офтальмологии), Е. Матильда Зиглер Foundation (МЭЗ и АСВ) и Национального Института глаза / NIH (МЭЗ , гранты R01EY015748 и R01EY017964).

Часть I. Настройка для ACT Пробирной <ol><li> Создание ограничен РНК для инъекций в соответствии с предложением производителя, используя свои фенол: хлороформ метод очистки (например, mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Амбион, Остин, Техас). РНК кодирования флуоресцентный белок используется в качестве индикатора. Мы транскрибировать либо желтый флуоресцентный белок (YFP) или mCherry 5 кДНК, которая находится в вектор экспрессии pCS2 +. </li><li> Вытяните боросиликатного стекла капилляров с образованием конической советы стекла, используя съемник микропипетки. Мы используем Саттер микропипетки Puller, Р-97 (Саттер Instruments, Inc, Новато, Калифорния), как описано выше 6. </li><li> Сделать стерильных растворов в таблице 1 от 10 X Марка изменения Рингера (MMR) маточного раствора (10 мМ MgCl 2, 20 мМ KCl, 20 мМ CaCl 2, 50 HEPES мМ, 1 М NaCl, доводили до рН 7,5, автоклавировать и хранить при RT). </li><li> Изолировать яички от мужчин лягушку и хранить ткани при температуре 4 ° С в стерильный раствор 1X MMR / гентамицин (50 мкг / мл гентамицина сульфата; BioWhittaker, Cat # 17-518Z). Это может быть сделано в течение недели до начала эксперимента, но она теряет свою эффективность с течением времени. </li><li> Яйцо укладки раствор (1X: 150 мМ NaCl, 2,62 мМ KCl, 0,8 мМ Na 2 HPO 4, 20 мМ Trizma базы, 2,62 мМ NaHCO 3 и 2,75 мМ MgSO 4, доводили до рН 7,6) могут быть сделаны как 8X акции, которые можно хранить при температуре 4 ° С до двух недель. Примечание: следите за загрязнение в этом решении, так как это повлияет на качество вашего яйца. </li><li> Создание инъекции пластин. Для этого растопите 1% агарозном в 0.4X MMR в микроволновой печи, добавьте ~ 6 мл расплавленного решение агарозы на 60 мм пластинами, слегка раскатать эластомера форму (рис. 1) в верхней части решение, чтобы избежать пузырей и дайте остыть в течение приблизительно 20 минут при комнатной температуре. Для определения количества необходимости, рассмотреть ряд экспериментальных условиях (например, 1, YFP, 2, YFP + Ноггин) и количество пересаженных эмбрионов хост необходимо. Для наших экспериментов, мы создаем не менее 20 пересаженных эмбрионов хост для каждой экспериментальной состоянии. На 18-19 ° C, эмбрионы будут на стадии 15 около часа. Если это занимает один час для проведения 20 трансплантаций, то две точки оплодотворения время необходимы, предполагая, что хозяин эмбрионов принять все трансплантатов. Таким образом, четыре блюда инъекции будут необходимы (2 ехр условия х 2 очка оплодотворения время = 4). Храните пластины при температуре 4 ° С не более одной недели. </li><li> Создание колпачок изоляции пластин с использованием 1% агарозном + 0,7 MMR с формы, как и для инъекций пластины. Сделать столько же крышка изоляции как закачка пластин плюс одна посторонняя за каждое очко время оплодотворения (4 + 2 точках оплодотворения время = 6). </li><li> Inject самок с 500 единиц человеческого хорионического гонадотропина в конце дня на день, предшествующий микроинъекции. Магазин женщин при температуре 16-18 ° С в течение ночи. </li></ol> Часть II. РНК микроинъекции Xenopus laevis эмбрионов А. Подготовка к микроинъекции <ol><li> Удалить гормонально индуцированной женщин и разместить их в отдельных резервуарах, содержащих 1X откладки яиц решение (ELS). Примечание: мы не используем яйца, которые были в ELS более двух часов, как и качество яиц снижается. Таким образом, примерно за час до оплодотворения в пробирке, отбросить все яйца из бака, так что только свежие яйца собираются. </li><li> Подготовка игла для микроинъекции по Ножницы с наконечником для получения 25-35 мкм в диаметре. Место иглу на picoinjector и калибровки так, чтобы она распределяет 10 NL на инъекцию. </li><li> Установить инкубаторе до 14 ° C. </li><li> Как только самки откладывали яйца в течение часа, удалить яйца из бака использованием передачи пипетки и их размещение в 60 мм чашки Петри. Удалить столько ELS из яиц, как можно и заменить 1X MMR. Яйца могут быть оплодотворены сразу или остаться в 1X MMR до часа. Для пересадки анализа, то лучше, чтобы оплодотворить два блюда, 80% из одного слоя яйца в до трех отдельных партий на уровне около 11 утра, в полдень и 1 час. После инъекции, они будут размещены в 14 ° С, так что они будут расти до желаемого этапы колпачок изоляции (стадия 8,5-9) и трансплантацией (стадия 15; см. Часть I, # 6 выше). </li><li> Для проверки качества яичек, мы выполняем рано утром оплодотворения (~ 8 утра), что позволяет нам извлечь яички от другого самца, если сперматозоиды от первого не является жизнеспособным. Примечание: мы гомогенизации ~ 0,25 яички в 1 мл 1X MMR и добавить примерно от 5 до 7 капель на чашку ооцитов. </li><li> В пробирке оплодотворить яйца с гомогенизированный яичек и, час спустя, удалить слой желе на яйца использованием де-желе решение (164μl 1M DTT + 10 мл 1М Трис, рН 8,8 до 50 мл воды автоклавного NanoPure). Подождите, пока они не достигают двух-клеточной стадии, чтобы начать сортировку, которая занимает около 2 часов при 18 ° С или 1,5 часа при комнатной температуре (22 ° С). </li><li> Использование Transfэ пипетки, сортировать равномерно пигментированные и равномерно деления эмбрионов, как показано в левой крышки животных на рисунке 3, в колодец инъекции блюдо заполнено 0.4X MMR + 6% Ficoll. </li></ol> Б. Микроинъекция <ol><li> Стретч парафильмом поверх 60 мм крышкой чашки Петри. Внесите 2 мкл ваш первый образец РНК на парафильмом и аспирации использованием PLI-100, чтобы заполнить Ваш инъекционной иглой. Не забудьте проверить, что игла находится еще дозирования 10 NL образца до начала инъекции. </li><li> Inject 20-30 двух-клеточной стадии эмбрионов (оба бластомеров) с 500 пг YFP РНК в одном блюде и ваш интерес гена (например, 20 пг Ноггин РНК), а также YFP ​​РНК в другом блюде 7. </li><li> Место 100-200 неинъекционные эмбрионы в момент времени, в другом инъекции блюдо с решением Ficoll. Переместите их в и из инкубатора в то же время, как вводить эмбрионы. Эти узлы, которые будут использоваться в Части IV. </li><li> После инъекции, инкубировать всех эмбрионов при 14 ° С в течение ночи. Повторите эти действия для всех временных точках. </li></ol> Часть III. Изолировать животных шапки из вводят эмбрионы <ol><li> Прибытие рано утром на стадии эмбрионов. Раннее время точка должна быть на стадии 9. Удалите те, которые не сохранились. Продолжайте следующие шаги работы с каждый момент времени в пакетном режиме. </li><li> Вылейте Ficoll решение от каждой пластины и добавить обратно 0,7 MMR / гентамицин решение. Чтобы блюдо изоляции крышкой, добавьте большом количестве 0,7 MMR / гентамицин решение. Выбить эмбрионы от их инъекции блюдо скважин с помощью пипетки передачи и место в только что приготовленное блюдо изоляции шапку. </li><li> Изолируйте животное шапки в 0,7 MMR раствор + гентамицин, сохраняя 2 или 3 неизменными эмбрионов для постановки. Либо Gastromaster, оснащенный желтый наконечник согнуты до 400 мкм, или пару острых № 5 щипцы могут быть использованы. </li><li> Положите шапки еще в 14 ° C инкубаторе до следующего дня. Хост эмбрионы должны быть удалены из инкубатора в то же время, как шапки, чтобы держать их на том же этапе развития в качестве донора ткани. </li></ol> Часть IV. Трансплантация колпачки на фланге <ol><li> Удалить колпачки и эмбрионы от первой точки времени от 14 ° C инкубатора и стадии эмбрионов. Сортировать для равномерного желтого или красного флуоресцентного-положительных шапки, в зависимости от трассирующих вводят внутривенно (рис. 2). </li><li> Подсчитайте количество крышек и удалить удвоить число этап 12-13 эмбрионов свежеприготовленный инъекции блюдо с 0,7 MMR / гентамицин решение. С резким щипцов # 5, удалить желточной мембраны от каждого. Передача их в тарелку с шапки, но будьте осторожны. Без их мембран желточной, эмбрионы могут быстро диссоциируют на поверхности воды. </li><li> Использование gastromaster (желтый наконечник, 200-250 мкм согнуты проволока, высокие настройки) или # 5 щипцы, удалить 200 мкм квадрат на стороне эмбриона на стадии 14-15 (рис. 3). Затем, разрезать пополам крышкой (с gastromaster или # 5 щипцы) и поместите ткань в отверстие, сделанное в принимающей эмбриона. Поворот эмбриона против хорошо, чтобы исцеление. Делайте это в течение как многие эмбрионы, как вы можете, пока они находятся на стадии 15. Повторите эти действия для всех временных точках. </li><li> Эмбрион, как правило, заживают в течение 30 минут. Удаление отмерших клеток (белые) с нежным чистки движения с # 5 щипцами. Вырастить их при 18 ° С в течение ночи. </li><li> Под рассекает флуоресцентного микроскопа, сортировать эмбрионов с флуоресцентно меченных, пересаженные ткани. Положите их обратно при 18 ° С расти до стадии 42-43. </li><li> Анестезию животных в tricaine. На данный момент, можно делать снимки под флуоресцентным микроскопом вскрытии. После того как вы сделали, исправить, раздел и immunostain или выполнить на месте гибридизации с использованием маркеров для ваших тканей, представляющих интерес. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="Рисунок 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Рисунок 1"> Рисунок 1. Дизайн оргстекла для литья эластомеров форма используется для изготовления блюд эмбриона холдинга. 38 х 38 мм круглый угол квадрата (~ 5 мм в глубину) был направлен из кусок оргстекла, что составляет 50 х 50 квадратных мм и толщиной 25 мм. Циркуляр, равномерно расположенных скважин (1,5 мм в диаметре) было пробурено 1 мм вглубь пластика. Для того, чтобы эластомера формы для микроинъекции посуду, заливают мы Sylgard эластомера в оргстекла и позволило ему укрепить, в соответствии с инструкциями производителя. Этот эластомер формы используется, чтобы сделать инъекцию и пластины крышки изоляции. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="Рисунок 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Рисунок 2"> Рисунок 2. Животное шапка сортировки до трансплантации важно, так как выражение может меняться. Животное крышки на левом выражает mCherry равномерно по всей ткани в то время как эксплантов на право имеет пятнистый выражения и будет отброшен. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="Рисунок 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Рисунок 3"> Рисунок 3. Хост tadpоле разработала глаз-подобную структуру на своем фланге от пересаженных клеток шапка животного. флуоресцентное изображение было наложенных на изображение светлого.

<ol><li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+noggin%2C+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li>
<li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li>
<li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Methods+in+Developmental+Biology%3A+Xenopus+%26+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).</li>
<li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li>
</ol>

В этом видео, мы продемонстрировали нашу версию классических методов, используемых биологами Xenopus, которые мы переставить создать трансплантации животным шапка анализа. При комнатной температуре эмбрионы Xenopus развиваются очень быстро через этапы 9 и 15. Разместив их на 14 ° C, развитие зародыша замедляется и многие другие трансплантации могут быть выполнены в одном эксперименте. Если необходимо расти эмбрионов старших возрастах (&gt; 42/43), то мы рекомендуем использовать трансгенных Венера YFP ж...

<table><tbody><tr><td>Набор mMessage mMachine SP6</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Боросиликатные капиллярные трубки (1,0 mm OD x 0,5 mm ID)</td><td>FHC, Inc.</td><td>27-30-1</td><td></td></tr><tr><td>Микропипеточный вытягиватель Sutter</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Гентамицина сульфат [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW17-528Z</td><td></td></tr><tr><td>Набор Sylgard/эластомер 1,1lb</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>Полистирольная чашка Петри 60 x 15 mm</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0160</td><td></td></tr><tr><td>ХГЧ человека (хорионический гонадотропин)</td><td>Intervet Inc.</td><td>22219</td><td></td></tr><tr><td>Системы микроинъекций Pico-Injector</td><td>Harvard Apparatus</td><td>650003</td><td></td></tr><tr><td>Инкубатор Torrey Pines Scientific ECHOtherm</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-680-21</td><td></td></tr><tr><td>Переносная пипетка</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>6290-20635A</td><td></td></tr><tr><td>Пинцет Dumostar №5</td><td>Fisher Scientific</td><td>11295-10</td><td></td></tr></tbody></table>

Ткань Определение Использование трансплантации животных cap (act) в Пробирной xenopus laevis</em

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Многие белки играют двойную роль в эмбриональном развитии. Те, которые регулируют определение ячейки судьбу в конкретной ткани также может влиять на развитие большей области эмбриона. Это делает определение ее роли в определенной ткани трудно анализировать. Например,<em&gt; Башка</em&gt; Гиперэкспрессия в<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Эмбрионов вызывает расширение всей передней части, в том числе глаз<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Из этого результата, то не известно, если Ноггин играет непосредственную роль в определении глаза или, что, вызывая расширение нервной ткани, Ноггин косвенно влияет на формирование глаз. Наличие этого комплекса фенотип делает изучение его глаз особую роль в ячейке определения судьбы трудно анализировать. Мы разработали анализа, что позволяет преодолеть эту проблему. Воспользовавшись плюрипотентных характер<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Животное крышкой<sup&gt; 3</sup&gt;, Мы разработали анализ, чтобы проверить способность гена продукт (ы), как и<em&gt; Башка</em&gt; Или глаз поле транскрипционных факторов (EFTFs), превратить шапки в определенной ткани или типов клеток путем пересадки этой ткани на стороне эмбриона<sup&gt; 4</sup&gt;. Хотя мы нашли либо лечения Ноггин белка или коллекции транскрипционных факторов может определить судьбу сетчатки ячейку в животных шапки, эта процедура может быть использована для идентификации гена продукт (ов), участвующего в определении других тканей, а также.

Животное шапки гиперэкспрессией гена продукт (ы) пересаживают на фланге развивающихся<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Эмбрионов для того, чтобы установить, является ли ткани определяется.

Ткань Определение Использование трансплантации животных Cap (ACT) в Пробирной Xenopus laevis</em

Многие белки играют двоякую роль в эмбриональном развитии. Белки, регулирующие определение судьбы клеток в конкретной ткани, могут также влиять на развитие...

Общая цель анализа ACT заключается в том, чтобы проверить, могут ли интересующий ген или гены определять развитие примитивной дермы по конкретному пути клеточной дифференцировки. Процедура начинается с гиперэкспрессии РНК, кодирующих флуоресцентный репортерный ген и интересующий ген или гены, в развивающихся эмбрионах Xenopus lavis. Следующим шагом является выделение животного полюса или примитивного эктодермального слоя, экспрессирующего данные РНК, и их выращивание до стадии 15.Третьим этапом процедуры является удаление ткани на боку эмбриона-хозяина на 15-й стадии развития. Заключительный этап заключается в трансплантации половины ткани донорской анимальной шапочки на бок эмбриона-хозяина и выращивании последнего до 42–43-й стадии. Результаты, полученные с помощью изготовления срезов и иммуноокрашивания на тканеспецифические маркеры, демонстрируют формирование эктопических тканей, таких как глазные структуры.Здравствуйте, я из отделения офтальмологии Медицинского университета Upstate. Сегодня я продемонстрирую процедуру, которую мы называем методом трансплантации живочного полюса эмбриона, разработанную мной в сотрудничестве с Майком Субером. Мы используем этот метод в обеих наших лабораториях для изучения генов, которые являются достаточными для формирования глаза.Приступим. Для начала данной процедуры подготовьте кэпированные РНК для инъекций: транскрибируйте noggin или другой интересующий вас ген, а также YFP, который будет использоваться в качестве маркера. Также подготовьте растворы на основе MMR, стоковый раствор яйцекладочного раствора 8х и иглы для инъекций в эмбрионы.Для изготовления чашек для удержания эмбрионов используется изготовленная на заказ эластомерная форма. Подготовьте по одной инъекционной пластине для каждого экспериментального условия, расплавив 1% AROS в 0,4 XMMR в микроволновой печи. Перенесите около шести миллилитров раствора в 60-миллиметровую пластину.Осторожно поместите эластомерную форму поверх раствора, чтобы предотвратить образование пузырьков, и дайте остыть в течение примерно 20 минут. При комнатной температуре создайте одну пластину для изоляции колпачков для каждого экспериментального условия, используя 1% AGROS плюс 0,7 XMMR с формами, как было показано ранее для инъекционных пластин. Подготовьте дополнительные пластины для каждой временной точки.Подробную информацию о расчете временных точек см. в прилагаемом письменном протоколе. Затем проведите изоляцию. Возьмите образцы от самца лягушки и храните ткань при температуре 4 °C в стерильном растворе 1X MME, дополненном 50 µg/ml гентамицина.Это можно сделать за неделю до начала эксперимента, однако следует учитывать, что со временем эффективность спермы снижается, поэтому процедуру рекомендуется проводить поздно вечером накануне микроинъекции. Введите самкам 500 единиц хорионического гонадотропина человека. Содержите самок при температуре от 16 до 18 °C в течение ночи.Теперь все готово к микроинъекциям на следующий день. Начните с того, что извлеките самок, подвергшихся гормональной индукции, и поместите их в индивидуальные емкости, в каждую из которых поместите один XELS. Подготовьте иглу для микроинъекции, отрезав ее кончик.Чтобы получить диаметр от 25 до 35 микрометров, установите иглу в пикоинжектор PLI 100 и откалибруйте его так, чтобы за одну инъекцию вводилось 10 нанолитров. Настройте инкубатор на 14 градусов Цельсия; помещение эмбрионов при более низкой температуре после инъекции РНК замедляет развитие зародыша, что позволяет провести гораздо больше трансплантаций в рамках одного эксперимента. Примерно за час до оплодотворения извлеките икру из аквариума. После того как самки отложили икру в течение дополнительного часа, используйте переносную пипетку, чтобы извлечь свежеотложенную икру из аквариума.Обратите внимание, что нельзя использовать яйца, которые находились в растворе ELS более двух часов. По мере снижения качества яиц поместите их в чашки Петри диаметром 60 мм. Чашка должна быть заполнена примерно на 80% одним слоем яиц.Удалите из яиц как можно больше ELS и замените его одним XMMR. Яйца могут находиться в одном XMMR до одного часа. Затем проведите оплодотворение яиц in vitro с использованием гомогенизата семенников.Рекомендуется проводить оплодотворение эмбрионов тремя отдельными порциями примерно в 11:00, в полдень и в 13:00, чтобы они могли развиться до нужной стадии: от 8,5 до 9 для изоляции колпачка и до стадии 15 для трансплантации. Через час после оплодотворения икры удалите желеобразную оболочку яиц с помощью раствора D-jelly, промыв их большим количеством 0,1 XMMR, а затем дождитесь, пока оплодотворенные икринки достигнут двухклеточной стадии.Для начала сортировки подготовьте планшет для инъекций, заполненный 0.4 XMMR с добавлением 6%F ccal. Когда эмбрионы достигнут стадии двух клеток, с помощью переносной пипетки перенесите равномерно пигментированные и равномерно делящиеся эмбрионы в лунку планшета для инъекций.Перейдите к микроинъекции: первым этапом растяните профиль поверх крышки чашки Петри диаметром 60 мм. Пипеткой нанесите 2 µL образца РНК на биопленку и аспирируйте. Используйте пикоинжектор для заполнения инъекционной иглы.Перед началом инъекции убедитесь, что игла по-прежнему дозирует 10 литров образца. РНК вводится в оба бластера эмбриона на стадии двух клеток. Введите по 500 пикограмм Y-F-P-R-N-A в 20–30 эмбрионов и поместите их в одну чашку.Введите в еще 20–30 эмбрионов по 20 пикограмм РНК Nain, предварительно смешанной с Y-F-P-R-N-A, и поместите их в чашку. Кроме того, поместите от 100 до 200 неинъецированных эмбрионов для каждой временной точки в другую чашку для инъекций, содержащую раствор FICO. Перемещайте эти эмбрионы в инкубатор и из него одновременно с инъецированными эмбрионами.Это организмы-хозяева, которые будут использоваться для пересадки колпачков после инъекции. Инкубируйте все эмбрионы при 14 °C в течение ночи. Повторите процедуру для всех запланированных временных точек.После инкубации в течение ночи можно выделить анимальную шапочку. Придите рано утром, чтобы определить стадию развития эмбрионов. Не забудьте также извлечь из инкубатора контрольные эмбрионы хозяина, в которые не вводили препарат.Самая ранняя временная точка должна соответствовать девятой стадии. Сначала удалите эмбрионы, которые не выжили. Затем приступайте к изоляции животных колпачков из жизнеспособных эмбрионов, обрабатывая эмбрионы каждой временной точки партиями, перенося их в чашку для изоляции колпачков.Добавьте достаточное количество раствора 0.7 XMMR с гентамицином. Затем слейте раствор с каждой чашки, содержащей инъектированные эмбрионы, и снова добавьте раствор 0.7 XMMR с гентамицином. Извлеките эмбрионы из лунок для инъекций с помощью трансфер-пипетки и перенесите их в свежеподготовленную чашку для изоляции под колпачком.Для изоляции анимальных полюсов в растворе 0,7 XMMR с добавлением Gentamycin используйте либо инструмент Gastro Master с желтым наконечником, согнутым под углом 400 micrometers, либо острый пинцет номер пять. Сохраните два или три неповрежденных эмбриона для определения стадии развития. После изоляции поместите анимальные полюса обратно в инкубатор при температуре 14 degrees Celsius вместе с эмбрионами-хозяевами до следующего дня, когда будет проведена трансплантация полюсов на боковую сторону эмбрионов-хозяев.Достаньте колпачки и эмбрионы-хозяева для первой временной точки из инкубатора, установленного на 14 °C, определите стадию развития эмбрионов и отберите колпачки с однородной положительной флуоресценцией. Подсчитайте количество колпачков и удалите их. Перенесите удвоенное количество эмбрионов-хозяев в свежеподготовленную чашку для инъекций с раствором 0.7 XMMR и гентамицином, используя острые пинцеты номер пять.Удалите ленильную мембрану с каждого эмбриона-хозяина. Перенесите их на планшет с колпачками, стараясь не повредить эмбрионы в отсутствие ленильных мембран. Эмбрионы могут быстро диссоциировать на поверхности воды; для этого используйте гастро-мастер, оснащенный желтым наконечником с изогнутой проволокой 200–250 мкм на максимальной настройке, или пинцет номер пять.Удалите квадрат ткани размером 200 мкм на боковой стороне эмбриона на стадии 14–15. Затем, снова используя гастро-мастер или пинцет № 5, разрежьте эксцизат пополам и поместите ткань в отверстие, сделанное в эмбрионе-хозяине.Повращайте эмбрион о стенку лунки, чтобы обеспечить заживление. Повторите эту процедуру для максимально возможного количества эмбрионов, находящихся на 15-й стадии. Повторите для всех временных точек.Эмбрион обычно заживает в течение 30 минут. Затем с помощью пинцета номер пять удалите омертвевшие клетки, которые выглядят белыми, осторожными выметающими движениями. Инкубируйте пересаженные эмбрионы при температуре 18 °C в течение ночи.После инкубации в течение ночи под флуоресцентным диссекционным микроскопом отберите эмбрионы с флуоресцентно меченными трансплантированными тканями. Поместите выбранные эмбрионы обратно при температуре 18 °C для выращивания до стадии 42–43. Когда животные достигнут нужной стадии, анестезируйте их в растворе трикаина, исследуйте под флуоресцентным диссекционным микроскопом и сделайте снимки.Затем пересаженные эмбрионы можно зафиксировать, разрезать на срезы и подвергнуть иммуноокрашиванию, либо провести гибридизацию in situ с использованием маркеров интересующей ткани. Ниже представлены репрезентативные результаты анализа головастика-реципиента с донорской тканью, экспрессирующей флуоресцентный трекер и noggin, через один день после трансплантации. Обратите внимание, что ткань сбивается в комок сбоку головастика.Эмбрионы-хозяева, получившие контрольную донорскую ткань, экспрессирующую только флуоресцентный маркер, уже начинают включать клетки животного полюса в область своего бока. Через несколько дней у головастиков, получивших донорские клетки, экспрессирующие nain, на боку формируются структуры, подобные глазам, в то время как у головастиков, получивших контрольную донорскую ткань, флуоресцентные клетки располагаются на поверхности кожи. Мы только что продемонстрировали вам, как проводить анализ трансплантации животного полюса у Xenopus laevis.При проведении этого анализа важно убедиться, что все необходимое подготовлено заранее, чтобы эмбрионы не развивались быстрее, чем вы сможете приступить к процедуре. На этом всё.Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.

tissue-determination-using-animal-cap-transplant-act-assay-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Xenopus эмбрионального эпителия являются идеальной системой модель для изучения ячейки поведения, таких как развитие полярности и изменением формы во время эпителиальных морфогенеза. Традиционные гистологии основных образцов все чаще дополняется жить-клеточной конфокальной микроскопии. Здесь мы показываем, методы, чтобы изолировать лягушки тканей и визуализировать жить эпителиальных клеток и их цитоскелета с использованием живых-клеточной конфокальной микроскопии.

Live-камера и цифровой обработки изображений Количественный анализ эмбриональных эпителиальных клеток в Xenopus laevis</em

Xenopus Хепориз обеспечивает идеальную модельную систему для изучения клетки спецификации судьбы и физиологические функции отдельных клеток сетчатки в первичной культуре клеток. Здесь мы представляем технику для рассечения тканей сетчатки и формирования первичных культур клеток, что загружаются кальция деятельности и проанализированы в гибридизация.

Dissection, культуры и анализ<em&gt; Xenopus Хепориз</em&gt; Эмбриональные ткани сетчатки

Методика пересадки "Экстремальный Передней домен" лицевой ткани между Xenopus Laevis эмбрионы была разработана. Ткань может быть перемещен из одного гена фоне выражения в другую, что позволяет изучение местных требований к черепно-лицевого развития и для взаимодействия между регионами лица сигнализации.

Трансплантация лица в<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; Эмбрионы

Рукопись здесь предоставляет простой набор методов для анализа секрецию и распространение флуоресцентно меченых лигандов в Xenopus. Это обеспечивает контекст для тестирования на способность других белков, чтобы изменить распределение лиганда и позволяет эксперименты, которые могут дать представление о механизмах, регулирующих морфогена градиенты.

Использование конфокальной Анализ<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; По расследованию модуляторы Wnt и Shh морфогена градиентов

У эмбрионов Xenopus клетки с крыши бластоцеля являются плюрипотентными и могут быть запрограммированы на генерацию различных тканей. В этой статье мы описываем протоколы использования кровельных эксплантов амфибий в качестве системы анализа для исследования ключевых особенностей раннего развития нервной системы in vivo и in vitro.

Стволовых клеток, как<em&gt; Xenopus</em&gt; Эмбриональные эксплантов для изучения раннего развития, особенности нейронных<em&gt; In Vitro</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em

Мы описываем систему ооцитов Xenopus и колпачков животных для экспрессии клонирования генов, способных вызывать ответ в компетентной эктодерме, и обсуждаем методы последующего анализа таких генов. Эта система полезна для функциональной идентификации широкого спектра генных продуктов.

Функциональная Клонирование Использование<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов выражение системы

Данная статья представляет собой удобный и быстрый способ для визуализации различных популяций клеток нейронов в центральной нервной системе Xenopus эмбрионов с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания на участках.

Оценка первичного нейрогенеза в<em&gt; Xenopus</em&gt; Эмбрионы Использование Иммунологическое

Этот протокол демонстрирует основанный на флуоресценции метод для визуализации сосудистой сети и для количественной оценки ее сложности у Xenopus tropicalis . Кровеносные сосуды можно визуализировать через несколько минут после введения флуоресцентного красителя в сердцебиение эмбриона после генетических и / или фармакологических манипуляций для исследования сердечно-сосудистого развития in vivo .

Визуализация и количественный анализ эмбрионального ангиогенеза у<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Мы описываем протокол ксенотрансплантации в желток прозрачных эмбрионов данио-рерио, который оптимизируется с помощью простого и быстрого метода стадирования. Постинъекционный анализ включает в себя выживаемость и оценку бремени болезни ксенотрансплантированных клеток с помощью проточной цитометрии.

Простой, быстрый и эффективный метод анализа ксенотрансплантации опухолей у прозрачных эмбрионов рыбок данио

Это первая часть комплексного протокола отбора проб Xenopus . Образцы тканей включают желудочек сердца, артериальный ствол, левую долю печени, желчный пузырь, легкие, поджелудочную железу, селезенку, гортань, пищевод, желудок, кишечник, яички, жировые тела, яйцевод, парные почки, седалищное сплетение, кожу, тимус и весь глаз.

Эффективные методы комплексного отбора проб доступных тканей у взрослых Xenopus

Изучите метод трансплантации животных шапочек в Xenopus laevis для определения судьбы тканей при развитии эмбрионов. Этот подход позволяет исследовать влияние генов на формирование клеточных типов.

Ткань Определение Использование трансплантации животных Cap (ACT) в Пробирной Xenopus laevis

Больше видео