Быстрое однородных Обнаружение биологических экспериментов с использованием магнитных система биодатчиков модуляции

Магнитная модуляция биосенсинга или MMB представляет собой новый метод детектирования биологических молекул. Здесь представлен анализ для подтверждения принципа, в котором детектируется интерлейкин 8; интерлейкин 8, также называемый IL 8, добавляется в реакционную смесь, содержащую магнитные частицы, покрытые антителами, с иммобилизованными антителами к IL 8 и флуоресцентно меченным стрептавидином. Создается молекулярный «сэндвич», который эффективно связывает флуоресцентную молекулу с магнитной частицей.

Реакционную смесь помещают в кювету и воздействуют на нее переменным магнитным полем. Градиенты создаются с помощью двух электромагнитных полюсов, которые приводят микросферы в колебательное движение. Периодическое перемещение прикрепленных к микросферям флуоресцентных белков через ортогональный лазерный луч создает флуоресцентный сигнал, который регистрируется ФЭУ и демодулируется.

С помощью синхронного усилителя можно визуализировать движение микросфер, используя CCD-камеру вместо ФЭУ. Синхронное движение наблюдается в образцах, где магнитные микросферы были связаны с флуоресцентными белками с помощью IL eight. Здравствуйте, я Адия из Лаборатории нелинейной оптики и лазеров кафедры физической электроники Тель-Авивского университета. Я НоГо с кафедры биологических наук Иллинойсского университета в Чикаго, а я Марсело Эрлих из отдела клеточных исследований и иммунологии Тель-Авивского университета.

Сегодня мы продемонстрируем метод быстрого гомогенного детектирования в биологических анализах с использованием биосенсорной системы с магнитной модуляцией. В нашей лаборатории мы применяем данную процедуру для обнаружения специфических белков и последовательностей ДНК в низких концентрациях. Итак, приступим.

Начните процедуру с подготовки и маркировки пробирки для каждой реакции, включая целевой образец и нецелевой контрольный образец. В каждую пробирку последовательно добавьте следующие компоненты набора Bio-Plex Precision Pro для анализа цитокинов: магнитные частицы, конъюгированные с антителами для детектирования IL-8, стрептавидин-PE и IL-8 Target. Доведите объем до 100 µL с помощью буфера для анализа, затем перемешивайте в течение 30 минут на компактном орбитальном шейкере.

После встряхивания образцов в течение 30 минут при комнатной температуре перенесите их непосредственно в кюветы для анализа. Очистите прозрачные кюветы системы MMB с помощью салфеток для очистки линз и 70% этанола. Прибор, используемый для анализа, состоит из лазера с удвоением частоты на 488 нанометров, который служит источником возбуждающего света и направляется с помощью дихроичного разделителя луча на 562 нанометра на объектив микроскопа.

Объектив микроскопа фокусирует лазер в пятно с диаметром луча 27 микрометров внутри боросиликатной стеклянной трубки шириной 400 микрометров. Излучаемый свет подвергается спектральной фильтрации с помощью двух последовательных полосовых фильтров, регистрируется фотоумножителем (ФЭУ) и демодулируется с помощью синхронного усилителя. Для подачи прямоугольного сигнала на каждый электромагнит поочередно используется самодельный модулятор тока.

Амплитуда должна составлять 1.4 amps при частоте от одного до шести hertz, так как микросферы входят в лазерный луч и выходят из него дважды за каждый цикл. Частота демодуляции на синхронном усилителе составляет от двух до 12 hertz. Запустите систему, повернув ключ лазера с длиной волны 488 nanometer в положение «вкл» и включив питание.

Затем установите мощность лазера на минимум, примерно четыре-шесть милливатт. Включите осциллограф, затем включите ФЭУ. Далее поместите образец между двумя электромагнитными полюсами.

Используйте поворотный стол вставки, чтобы обеспечить прохождение лазерного луча через вставку без касания её стенок. Используйте предметный столик с перемещением по осям XY и Z, чтобы изменить положение вставки относительно объектива и электромагнитных полюсов. Для оптимизации ввода флуоресцентного излучения в детектор вставку следует расположить немного за линией полюсов.

Теперь переведите осциллограф в режим измерения временной развертки. Установите управление усилением ФЭУ на 0.5 bolts. Затем включите модулятор тока и установите частоту на три hertz.

Подождите 30 секунд для агрегации и конденсации бусин. Магнитные бусины начнут колебаться, перемещаясь к передней части пробирки. Когда лазерный луч попадет на колеблющиеся бусины, должно быть заметно мерцание отраженного лазерного света от бусин.

Обратите внимание, что частицы перемещаются быстрее при увеличении модуляции тока и медленнее при ее уменьшении. Положение частиц в пробирке можно регулировать с помощью предметных столиков с микрометрическим управлением. Для перемещения полюсов движение частиц можно визуализировать с помощью ПЗС-камеры, установленной вместо ФЭУ.

Осциллограф регистрирует периодический сигнал от флуоресцентно-связанных микросфер; запишите временную диаграмму осциллографа. Сохраненные данные можно проанализировать с помощью MATLAB. Реакционные смеси с добавлением IL8 и без него были исследованы методом MMB. Во всех реакциях с мишенью микросферы образовали единый плотный агрегат, который синхронно перемещался в область лазерного луча и обратно.

Однако в отсутствие мишени бусины агрегировали в меньшей степени, а их движение было менее согласованным. Здесь тактовый сигнал модуляции полюса, показанный желтым цветом, и выходной сигнал ФЭУ, показанный пурпурным цветом, отображают частоту модуляции для каждого полюса, составляющую 2 Hz. Таким образом, частота демодуляции составляет 4 Hz, что соответствует теоретическим ожиданиям.

Когда частицы проходят через лазерный луч, ФЭУ регистрирует флуоресцентный свет; при подаче сигнала с ФЭУ и тактового сигнала двойной модуляции на синхронный усилитель возникает пик выходного напряжения ФЭУ. Чувствительный фазовый детектор обеспечивает синхронизацию и выдает результат в виде высокого напряжения. Два цвета соответствуют двум различным сканированиям при одной и той же концентрации мишени.

Черные линии представляют собой среднее значение каждого сигнала. При тестировании контрольного образца синхронный усилитель не обнаружил никакого сигнала. В данном случае синхронный усилитель не выдал синхронного сигнала.

Этот факт, наряду с визуальной разницей в агрегации, позволяет предположить, что система MMB и различие в измерениях временной зависимости выходного сигнала ФЭУ могут четко идентифицировать присутствие мишени IL8. Мы только что продемонстрировали способ быстрого и гомогенного обнаружения биологических молекул с использованием магнитной модуляции на примере биосенсинга IL8.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости соблюдения правил техники безопасности при работе с лазером. На этом всё. Спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах.