Тонкие секционирования фрагмент Подготовка к Immunohistochemistry
28 апреля 2007 г.
Настоящий метод позволяет воспроизводимых криостат секционирования маленький, трудно в управлении, тканевой части, такие как биопсия и мозг ломтиками. Мы используем простой этап замораживания алюминия для облегчения обработки ткани и стандартных криостате в плановом порядке выпускать 5-10 микрон серийных срезов от 400 микрон ломтики мозга.
Здравствуйте, меня зовут Джун Пак, я научный сотрудник Гарвардской медицинской школы, а также студент-медик медицинского колледжа Университета Y при госпитале Северанс в Южной Корее. В данном видео представлены материалы для изготовления тонких срезов из препаратов срезов. Я готовлю форму из ленты на платформе OCT.
Я заливаю образец в OCT и замораживаю его в криостате или с использованием измельченного сухого льда, затем удаляю излишки OCT вокруг замороженной платформы. Я демонстрирую совмещение меток на замороженном блоке и монтажном столе криостата, после чего фиксирую блок. Я выполняю срезы через платформу с OCT.
Поверхность препарата из Онтарио плоская. Я снимаю платформу с OCT и помещаю ее на стол заморозки криостата. Я помещаю этот образец в OCT; данный образец был предварительно криоконсервирован в 30% растворе глицерина или сахарозы в PBS.
На этом этапе подготавливается колонка для замораживания; внешнее кольцо должно выступать примерно на пять миллиметров над верхней частью формируемой колонки, создавая углубление для OCT. Я осторожно помещаю образец ткани в центр поверхности колонки для замораживания и медленно добавляю OCT, пока углубление не будет заполнено. Затем я окружаю колонку для замораживания дробленым сухим льдом.
Ткань и OCT должны полностью замерзнуть в течение 20–60 секунд. По мере повышения температуры препарата внешнее кольцо можно снять, пока образец остается замороженным. На этом этапе образец сдвигают в сторону из колонки для заморозки и помещают в криостат.
Я наношу каплю OCT на поверхность платформы для OCT и помещаю образец, прижимая его; образец быстро замерзает на платформе OCT. Это этап закрепления образца на рабочем столе криостата с выравниванием меток. Я произвожу срезы через слой OCT, расположенный поверх ткани образца.
Я наношу тонкие срезы тканей на предметные стекла и храню их в замороженном состоянии или при комнатной температуре; реакции могут проводиться с тканями, закрепленными на предметных стеклах. Реактив наносится на стекло, затем следует осторожное перемешивание; если реагент светочувствителен, стекло можно накрыть. Последующие этапы реакции легко выполняются путем погружения стекла в емкость с отходами, слива излишков реагента и последующего нанесения следующего состава.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данный метод позволяет воспроизводимо выполнять криостат-секционирование небольших или сложных образцов тканей, включая биоптаты и срезы головного мозга. В методе используется простой алюминиевый замораживающий столик для облегчения работы с тканью и стандартный криостат для получения серийных срезов толщиной 5-10 микрон из срезов головного мозга толщиной 400 микрон.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Гистология
- Обработка тканей
Теоретические основы
- Срезы на криостате необходимы для изучения небольших образцов тканей.
- Работа с малыми биоптатами и срезами мозга может быть технически сложной.
- Стандартные методы могут не обеспечивать воспроизводимых результатов.
- Улучшенные методики позволяют повысить качество срезов тканей.
Цель исследования
- Разработать надежный метод изготовления срезов из небольших образцов тканей.
- Облегчить работу с фрагментами тканей, которые трудно фиксировать или перемещать.
- Обеспечить получение однородных и высококачественных серийных срезов.
Используемые методы
- Использование алюминиевой платформы для замораживания.
- Стандартный криостат для изготовления срезов.
- Изготовление срезов толщиной 5-10 мкм.
- Подготовка срезов мозга толщиной 400 мкм.
Основные результаты
- Успешное получение срезов из небольших образцов тканей.
- Воспроизводимость толщины срезов.
- Улучшенная работа с трудными в обработке типами тканей.
- Стабильное получение серийных срезов для анализа.
Заключение
- Данный метод расширяет возможности исследования небольших образцов тканей.
- Он представляет собой надежный подход для специалистов в области нейробиологии.
- Перспективы применения метода включают анализ различных типов тканей.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод решает проблему работы с малыми и хрупкими образцами тканей в нейробиологических исследованиях, обеспечивая воспроизводимое получение тонких срезов для последующего иммуногистохимического анализа. Он способствует валидации мишеней и снижению рисков при изучении механизмов, предоставляя согласованные гистологические данные из областей мозга, охарактеризованных с помощью электрофизиологии. Этот подход повышает прогностическую достоверность доклинических моделей за счет улучшения качества данных при ограниченном объеме исходного биологического материала.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы с помощью цитоархитектонического анализа зарегистрированных областей мозга.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимую подготовку тканей для иммуногистохимического окрашивания мишеней — ионных каналов или рецепторов.
- Прогностическая ценность: Повышает достоверность выбора мишени за счет связывания функциональных электрофизиологических данных со структурной валидацией.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для скрининга на основе антител и детектирования биомаркеров.
- Практическая ценность: Обеспечение равномерности толщины срезов (5-10 µm) для воспроизводимой интенсивности окрашивания и количественного анализа.
- Ценность платформы: Возможность серийного срезания из архивных препаратов для высокопроизводительных рабочих процессов окрашивания.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Сохраняет релевантность патологии за счет сбережения областей ткани, определенных электрофизиологически, для гистологической корреляции.
- Операционная ценность: Обеспечивает преемственность от этапа выявления функциональных особенностей к структурной валидации в доклинических моделях.
- Снижение рисков: Уменьшает количество ложноотрицательных результатов в исследованиях взаимодействия с мишенью благодаря надежному сечениям и окрашиванию.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс поиска новых соединений, обеспечивая возможность гистологического подтверждения результатов после функционального скрининга на препаратах срезов мозга.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез, обеспечивая структурную валидацию электрофизиологически активных областей.
- Скрининг: позволяет получать готовые к анализу срезы тканей с однородной толщиной для иммуногистохимического анализа и гибридизации in situ.
- Аналитика: обеспечивает получение количественных морфологических данных, которые помогают сравнивать эффекты терапии при различных условиях.
- Трансляционные исследования: связывает функциональные открытия с доклинической преемственностью посредством цитоархитектурного сопоставления мест регистрации сигналов.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность многократного применения методики обработки образцов тканей, полученных в ходе электрофизиологических исследований, в различных проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов за счет снижения вариабельности при подготовке тканей для иммуногистохимического анализа.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию и воспроизводимость процесса изготовления срезов для разных пользователей и сессий.
- Стратегическая ценность: упрощает принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), предоставляя надежные структурные данные, дополняющие функциональные результаты.
- Влияние на портфель проектов: поддерживает приоритизацию с учетом рисков за счет получения более достоверных данных по валидации мишеней.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с тканями, эксплуатацией криостата и протоколами иммуногистохимического окрашивания.
- Зависит от наличия криостата, компонентов камеры для замораживания и состава OCT для заливки тканей.
- Необходима стандартизация процедур замораживания и срезания в разных лабораториях для получения воспроизводимых результатов.
- Требуется учет особенностей адаптации для различных типов тканей, помимо срезов мозга, например, для биоптатов или органоидов.
- Ограничено необходимостью предварительного использования срезов в электрофизиологии, что может снизить пропускную способность в отдельных гистологических рабочих процессах.
