Извлечение ДНК из Gut микробы Термит (Zootermopsis Angusticollis) и Визуализация Gut Микробы

Здесь ваша реакция на эту среду не уникальна, не уникальна. Большинство людей, даже не ученых, просто поражены. да. По, Разнообразие и сложность.

Здравствуйте, меня зовут Эрик Мэтсон, и я являюсь постдоком на кафедре экологической и научной инженерии здесь, в Калифорнийском технологическом институте. Моя работа под руководством профессора Джареда Ледбеттера сосредоточена на микробных взаимодействиях и разнообразии видов, населяющих заднюю кишку термитов. В частности, нас интересуют некоторые биохимические пути, которые протекают, и особенно нас интересует процесс агенезии, в результате которого эти микробы потребляют водород и CO2 и превращают их в ацетат, который является ключевым питательным веществом энергетического метаболизма термитов-хозяина.

Я и другие сотрудники лаборатории разработали целевые наборы праймеров, чтобы иметь возможность исследовать ключевые ферменты в этом пути. Но для этого нам необходимо создать чистые образцы ДНК сообщества сообщества, ДНК, чтобы использовать их в качестве мишеней для этого процесса. Сегодня я хотел продемонстрировать, как мы препарируем виды термитов, о которых мы говорим, извлекаем ДНК из задней кишки, а затем очищаем ее и используем для дальнейших исследований.

Сегодня мы сосредоточимся на одном из видов термитов, в частности на Zo Opsis Nevadensis. Это калифорнийский термит из влажной древесины, собранный здесь здесь, и это довольно крупный вид, что позволяет довольно легко проводить вскрытие и извлечение из него. Итак, сегодня я уже приготовила некоторые материалы, которые нам понадобятся для процедуры.

Первое, что нам нужно, это определенное количество льда, чтобы охладить насекомых, которые будут препарироваться. Я также предварительно охладил некоторое количество TE-буфера, и он содержит соединение, которое поможет стабилизировать ДНК, как только она будет высвобождена из клеток здесь. У меня есть стерильные флаконы, предварительно загруженные шариками циркония и циркония.

Это бусины толщиной 0,1 миллиметра, и их здесь около полуграмма. Это то, что мы на самом деле будем делать, механические ножницы. А еще у меня есть пара реактивов, задействованных в процедуре лизиса и очистки.

Здесь у меня есть бутылка, содержащая 1% поливинилполиOne или PVPP в буфере. PVPP важен для удаления гуминовых кислот из препов ДНК, которые могут препятствовать нашему ПЦР-анализу результатов. Кроме того, у меня есть сульфат натрия ECCO, который является поверхностно-активным веществом, которое мы будем использовать для извлечения и разрушения клеток.

А затем для вскрытия термитов все, что нам нужно, это несколько стерильных щипцов. Они имеют довольно тонкие наконечники, и это то, что мы на самом деле будем использовать для удаления кишечных следов. И, наконец, для механической стрижки, у нас есть устройство для избиения пчел, которое вращается на очень высоких оборотах, и оно, вместе с силикатными шариками циркония, будет механически разрушать ячейки.

Итак, после того, как мы собрали термитов в полевых условиях, мы привозим их обратно в лабораторию. Большинство калифорнийских влажных древесных термитов, с которыми мы работаем, очень склонны к высыханию. Одним из достижений, которые мы добились в этой лаборатории, является использование камер с контролируемой влажностью, таких как эти 10-галлонные аквариумы.

Внутри мы собираем отдельные колонии и храним их отдельно в этих коробках. А в основании бака в основном находятся емкости, которые имеют разные солевые растворы. Этот конкретный содержит раствор фосфата калия, который поддерживает относительную влажность на уровне от 95 до 96%, что идеально.

И в этих условиях термиты размножаются в неволе, хотя, когда мы хотим провести эксперимент, мы собираем свежие материалы в поле. Но в этом ящике можно увидеть часть древесины, которой они питаются. Это просто Пондероза или сосна Джеффри, которую мы собираем на месте гнезда термитов.

Существует ряд различных видов термитов, в том числе мужских и женских репродуктивных особей. Большая часть колонии состоит из рабочих термитов с большим количеством солдатских кастов. Интересно, что у солдат есть челюсти в ротовой части, которые предназначены для защиты колонии, а не для поедания древесины.

И поэтому они зависят от рабочих термитов, которые их тоже кормят. И вы можете видеть в этой коробке как рабочих, так и солдатских термитов, а также некоторых молодых термитов, которые недавно вылупились из яиц. Ну и в плену здесь.

Итак, я выбрал пять рабочих термитов из группы, которую я только что показал вам. И я начал с того, что охладил их на льду. Чтобы подготовиться к вскрытию, я собираюсь использовать эти щипцы и работать с помощью препарирующего эндоскопа, и, надеюсь, вы сможете увидеть большой объем кишки, который мы сможем извлечь, у каждого из этих людей.

Просто переверните термита на спину, и одним щипцом вы возьмете головку, а другим только ущипнете. Как раз на самом кончике живота здесь. А с помощью одного полюса вы должны видеть, как кишечный тракт выводится из организма. Хорошо.

И вы можете видеть, что большой объем, примерно 30%, 40% веса насекомого, на самом деле содержится в этой среде. И вы можете видеть, что он разделен на несколько разделов. У нас есть четыре кишки, а затем средняя кишка, а затем эта задняя кишка, которая представляет собой очень большую камеру, содержащую большую часть микробного сообщества, осуществляющего ферментацию.

Итак, здесь я удалил внутренности пяти рабочих термитов. И теперь следующим шагом будет стабилизация нуклеиновых кислот, которые содержатся в сообществе здесь, в растворе ледяного буфера. На этом этапе они могут замерзнуть при температуре минус 20 градусов по Цельсию, если вы работаете в поле.

Или мы можем сразу же продолжить процедуру экстракции. Но все клетки и, и, а также материал ДНК все еще содержатся в кишечнике. И я просто собираюсь поместить их в 100 микролитров буфера.

Хорошо, прежде чем я начну извлекать образцы кишечника, мне нужно подготовить буфер, который я собираюсь использовать для разрушения клеток и тканей в них. Итак, к этой трубке, в которую у меня уже есть около полуграмма цирконовых шариков, я собираюсь добавить PVPP 700 микролитров этого. Это 1%-ный буфер и 50 микролитров 20%-ного раствора SDS.

Важно повторно суспендировать PVPP перед его добавлением, так как он нерастворим в водных буферах. На этом этапе мы готовы добавить фенол в образец, поэтому я собираюсь использовать пипетку, чтобы добавить около 500 микролитров или около того. Хорошо. И на этом мы готовы начать добычу. да.

С добавлением фенола мы готовы добавить образец кишечника, который мы ранее препарировали у термита, так что это помогает немного мацерировать ткани. Это, как правило, несколько облегчает перевод. И теперь, с добавлением фенола, мы готовы приступить к механическому разрушению с помощью устройства для бисерных валиков.

Техника, которую мы собираемся использовать, состоит из трех циклов на полной скорости, 30 секунд, а затем 30 секунд на льду. Важно включить ступеньку на льду, чтобы охладить образец, потому что он имеет тенденцию нагреваться из-за трения. Итак, я просто вставлю образец в устройство для бисероплетения, и я буду работать 30 секунд. Хорошо.

В конце процедуры вы должны увидеть, что большая часть ткани была гомогенизирована. Должно остаться очень мало комков, и вы увидите, что они имеют какой-то пенистый вид, вероятно, из-за SDS там. На этом этапе мы готовы к центрифугированию, а затем к собственно экстракционной очистке самой ДНК из этого образца.

Теперь, когда мы механически разрушили клетки, мы собираемся центрифугировать нерастворимый материал. Мы сделаем это, поместив центрифугу и используя гравитацию в 8 000 раз в течение одной минуты. И теперь мы ожидаем увидеть большую часть растворимого материала, собранного на дне пробирки.

И то, что нас интересует, — это водный раствор в верхней части. И это то, что мы собственно добавим в набор для экстракции ДНК KaiGen после процедуры получения сырого лизата. Теперь, когда у нас есть центрифуга для образцов, мы возьмем 200 микролитров на каждый препарат надосадочной жидкости, и мы собираемся извлечь ДНК с помощью набора A-D-N-E-Z KaiGen, используя протокол, указанный для сырого лизата.

Теперь у нас есть 200 микролитров образца кишечника, и я собираюсь продолжить использование набора kyogen d easy, используя протокол, указанный для сырого лизата. Всякий раз, когда мы проводим экстракцию кишечника, всегда полезно проверить состояние содержимого кишечника. Мы делаем это, препарируя термита и просто убеждаясь, что он представляет то, что мы видели в прошлом.

На самом деле мы сделаем это визуально, глядя на клетки этого микробного сообщества. Как раз на самом кончике живота здесь. А с помощью одного полюса должен быть виден кишечный тракт.

Так что это всего лишь буферизованный раствор соли, который очень близко соответствует составу реальной кишечной жидкости термита. И я просто немного мацерирую это, а затем добавлю это на предметное стекло микроскопа, и мы посмотрим. Хорошо, теперь мы готовы посмотреть на это в микроскоп.

Да, это выглядит очень хорошо. Кишечник термита. Здесь есть представители всех трех признанных сфер жизни.

Есть эукариотические простейшие, есть метамфетаминовые организмы, а есть также бактерии. И наша лаборатория в основном занимается популяцией бактерий в этой среде. А именно SPI kes в этом конкретном типе термитников являются одними из самых доминирующих среди бактериальных членов сообщества.

И наше текущее исследование показывает, что на самом деле они в значительной степени участвуют в кетогенезе, восстанавливающем CO2. Итак, это просто различные типы простейших, и считается, что они участвуют, а именно, в первичном распаде древесины. Считается, что они содержат xin AE и целлюлазу, которые позволяют их ферментам получать доступ к этим древесным полимерам.

И, а затем они ферментируют их в моносахарные мономеры и полимеры, которые в дальнейшем расщепляются другими членами сообщества. Эти простейшие также сами производят ацетат, но одним из их побочных продуктов являются водород и CO2, и этот водород и CO2 в свою очередь используются или потребляются популяциями ацето в этой среде. И здесь вы можете увидеть рой простейших организмов, вероятно, прямо рядом с очень большим видом, трюков и инф.

Это один из самых крупных организмов в кишечнике термитов. Когда вы спуститесь вниз и посмотрите на области, которые не содержат этих больших клеток простейших, вы увидите, что фоном является этот вид интерстициальной жидкости, которая также наполнена spi, keet и другими бактериальными клетками. И поэтому, вы знаете, сложность не становится меньше даже в этих областях.

Одна из вещей, на которую я должен обратить внимание, это то, что типичный объем удара в заднюю кишку, такой как тот, который мы рассмотрели здесь, составляет от двух до пяти микролитров в зависимости от размера термита. Таким образом, подготовка к влажному монтированию, которую я здесь сделал, на самом деле представляет собой как минимум 1 к 20 разбавлению этой среды. И на самом деле эти виды упакованы гораздо, гораздо плотнее в неповрежденном кишечнике, чем то, что представлено здесь.

Это дает вам некоторое представление о плотности и разнообразии жизни в этой среде. Сегодня я показал вам, как мы выделяем ДНК из кишечника термитника с помощью этих очищенных образцов. Теперь мы сможем применять конкретные целевые наборы грунтовок.

А именно, мы будем рассматривать гены формы дегидрогеназы, дегидрогеназы угарного газа и формального синтеза тетрагидрофолата, которые являются тремя наборами праймеров, разработанных нашей лабораторией. Мы заинтересованы в изучении разнообразия и специфических характеристик последовательности ряда этих различных генов для этой среды. Это будет включать в себя ПЦР-амплификацию различных генов, их клонирование, секвенирование и создание инвентаризации генов.

Основываясь на полученных результатах, мы можем узнать кое-что о природе некоторых из этих взаимодействий и, в частности, о том, как эти пути строятся в этих различных микроорганизмах в ходе этого процесса.