Дифференциация эмбриональных стволовых клеток в олигодендроцитов прекурсоров

Общая цель данного эксперимента заключается в получении предшественников олигодендроцитов из эмбриональных стволовых клеток с помощью серии этапов культивирования в течение 30 дней. Это достигается путем создания эмбриональных тел из ЭС-клеток мыши, чтобы инициировать дифференцировку клеток. На втором этапе тела эмбриона обрабатываются малыми молекулами, ретиноевой кислотой и чистым морфином, которые вызывают направленную дифференцировку клеток в логово лига.

Предшественники цитов. На третьем этапе тела эмбриона распадаются на отдельные клетки еще через 22 дня. В культуре примерно 80% клеток являются OPC.

Затем полученные MESC OPC трансдуцируются вирусами bao, несущими субъединицу NAV 1.2, чтобы получить спайковые OPC, результаты которых показывают экспрессию маркера OPC и спайкинговые свойства этих полученных MESC OBC на основе иммунофлуоресцентной микроскопии и электрофизиологических записей. Здравствуйте, я Понг Чанг из лаборатории доктора наук на кафедре клеточной биологии и анатомии человека в Калифорнийском университете в Дэвисе. Мы также сотрудничаем с детской больницей Шрайнерс в Северной Калифорнии.

Привет, я Виал Радж, тоже из лаборатории Дэн. Сегодня мы покажем вам процедуру дифференцировки стволовых клеток эмрона мыши в клетки-предшественники геноцида. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения свойств предшественников олигодендроцитов эмбриональных стволовых клеток с целью получения клеток с лучшим терапевтическим потенциалом.

Итак, приступим. Сегодня клетки-предшественники олигодендроцитов или OPC будут генерироваться из линии эмбриональных стволовых клеток мыши OG two GFP. Эти эмбриональные стволовые клетки необходимо пропускать каждые три дня, чтобы поддерживать их здоровыми с оптимальной плотностью и предотвращать спонтанную дифференцировку. Проход.

Клетки ESS, когда они находятся на 70% конфлюенции под ламинарным проточным колпаком. Удалите среду над культурой. Промойте глаза PBS и трипсином с двумя миллилитрами предварительного тепла.

Одна поездка на LE express за пять минут при температуре 37 градусов по Цельсию. Остановите реакцию и ресуспендируйте клетки в четырех миллилитрах клеточной среды MES. Переложите ячейки в коническую трубку объемом 15 миллилитров и гранулируйте их при 1000 RP в течение пяти минут.

Ресуспендируйте в средней пластине MESL, одну 10-ю часть клеток над сливающимся слоем облученных питателей метамфетамина в клеточной среде MES. Через три дня ЭС-клетки примерно на 70% сливаются и готовы к прохождению или суспензии для формирования эмбриональных тел, индуцирования эмбриональных тел и начала дифференцировки колоний мышиных ЭС-клеток трипсина, как и раньше, а затем ресуспендирования клеток в нокаут-сыворотке или среде KSR. Подсчитайте клетки на гемо ТЭР, разведите суспензию в КСР.

От среды до 15 000 клеток на миллилилитровую пластину по три миллилитра в каждую лунку с ультранизким присоединением шести лунок планшетной культуры. Подвешенные элементы при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех дней. Полностью меняйте среду каждые два дня.

Начиная с четвертого дня, ежедневно заменяйте среду на четвертый день Добавляйте KSR 0,2 микромолярной ретиноевой кислоты на пятый день, дополняйте ее ретиноевой кислотой и одним микромолярным примором голода на шестой и седьмой день. Скармливайте тела эмбрионов в двух средах, дополненных 0,2 микромолярной ретиноевой кислотой и одной микромолярной приморной жидкостью для голода. После восьми дней культивирования большинство эмбриональных тел экспрессируют GFP и готовы к дезагрегированию трипсиновых глаз и подсчету клеток, как и раньше.

Затем ресуспендируют их в 3,5 раза по 10 до пятой клетки на миллилитр. В среде ОПЦ откаливают три миллилитра суспензии в среде ОПЦ. Используя покрытые полиорнитином 60-миллиметровые чашки примерно каждую неделю, клетки будут сливаться и будут выглядеть как этот проход к клеткам, как и раньше, с трехминутной трипсинизацией.

Через 30 дней после первоначальной приостановки реанимации. В среде KSR клетки демонстрируют характеристики клеток-предшественников олигодендроцитов для генерации спайковых OPC. Используйте OPC, полученные из ESL мыши, которые конфлюентны от 50 до 70%.

Замените среду на одну XPBS для промывки клеток. Для введения напряжения стробируемый натрий. Канал 1.2 альфа субъединица.

Мы используем задний комплект натриевых каналов MAM. Смешайте один миллилитр заднего MAM компонента А с четырьмя миллилитрами одного XPBS. Снимите ополаскиватель PBS и добавьте разведенный компонент.

А инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. Замените агент задней памяти на носитель OPC, усиленный компонентами B и C, как описано в комплекте. Инструкции инкубируют еще два часа при 37 градусах Цельсия.

После инкубации замените усиленную среду свежей средой OPC. После еще 24 часов культивирования полученные из ESL OPC могут быть проанализированы на спайкинг в этот момент времени. EBS не показывает флуоресценцию GFP.

ЭБС демонстрируют сильную экспрессию GFP и готовы к дезагрегации культивирования в течение примерно 30 дней после первоначальной реактивной дисквалификации. В среде KSR большинство клеток иммунопозитивны на окрашивание NG 2, что согласуется с экспрессией GFP. Однако, в отличие от OPC мозга, эти OPC, полученные из MES-клеток, не могут активировать потенциалы действия, даже когда клетки были деполяризованы до нуля милливольт.

После введения субъединицы NAV 1.2 путем вирусной трансдукции, эти OPC, полученные из MES-клеток, возбуждаются и активируют потенциалы действия. Мы только что показали вам, как дифференцировать эмбриональные стволовые клетки мыши в OPC и генерировать спайковые OPC путем вирусной трансдукции. При выполнении этой процедуры важно помнить о правильном хранении ретиноидной кислоты в расчете на морфин и два FGF и всегда использовать свежие аликвоты, а после использования выбрасывать лишнюю t-ретиноидную кислоту.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.