Дифференциация эмбриональных стволовых клеток в олигодендроцитов прекурсоров

Общая цель следующего эксперимента — получение предшественников олигодендроцитов из эмбриональных стволовых клеток посредством серии этапов культивирования в течение 30 дней. Это достигается путем первоначального формирования эмбриональных тел из ЭСК мыши для инициации дифференцировки клеток. На втором этапе эмбриональные тела обрабатывают малыми молекулами — ретиноевой кислотой и чистым морфином, которые индуцируют направленную дифференцировку клеток в лигаден.

Предшественники цитов. На третьем этапе, спустя еще 22 дня, тела эмбрионов диссоциируют до состояния отдельных клеток. В культуре примерно 80% клеток представляют собой OPC.

Далее, OPC, полученные из MESC, трансдуцируют вирусами bao, несущими субъединицу NAV 1.2, для получения OPC со способностью к генерации спайков; в результате с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии и электрофизиологических записей подтверждается экспрессия маркера OPC и спайковые свойства этих OBC, полученных из MESC. Здравствуйте, я Понг Чианг из лаборатории доктора Инга на кафедре клеточной биологии и анатомии человека Калифорнийского университета в Дейвисе. Мы также сотрудничаем с Детской больницей Шрайнеров в Северной Калифорнии.

Здравствуйте, я Виал Радж, также из лаборатории Денга. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши в клетки-предшественники олигодендроцитов. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения свойств предшественников олигодендроцитов, полученных из эмбриональных стволовых клеток, с целью создания клеток с более высоким терапевтическим потенциалом.

Итак, приступим. Сегодня мы получим клетки-предшественники олигодендроцитов или OPC из линии эмбриональных стволовых клеток мыши OG2-GFP. Эти эмбриональные стволовые клетки необходимо пересаживать каждые три дня, чтобы поддерживать их жизнеспособность при оптимальной плотности и предотвращать спонтанную дифференцировку. Пересадка.

Клетки ESS при достижении 70% конфлюэнтности в ламинарном шкафу. Удалите среду из культуры. Промойте PBS и обработайте трипсином, добавив 2 mL предварительно прогретого раствора.

Инкубируйте смесь один раз в течение пяти минут при 37 °C. Остановите реакцию и ресуспендируйте клетки в четырех миллилитрах клеточной среды MES. Перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл и осадите их центрифугированием при 1000 об/мин в течение пяти минут.

Перенесите суспензию в чашку с питательной средой MESL, высев одну десятую часть клеток на конфлюэнтный слой облученных фидерных клеток мыши в среде MES. Через три дня ЭСК достигают примерно 70% конфлюэнтности и готовы к пассажированию или суспендированию для формирования эмбриональных тел с целью их индукции и начала дифференцировки. Обработайте колонии ЭСК мыши трипсином, как описано ранее, а затем ресуспендируйте клетки в среде с заменителем сыворотки Knockout или среде KSR. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра и разбавьте суспензию в KSR.

Вносите по 3 мл среды с концентрацией 15 000 клеток на мл в каждую лунку 6-луночного планшета с ультранизкой адгезией. Культивируйте суспендированные клетки при 37 °C в течение четырех дней. Полностью заменяйте среду каждые два дня.

Начиная с четвертого дня, ежедневно заменяйте среду. На четвертый день добавьте в KSR 0,2 мкМ ретиноевой кислоты. На пятый день добавьте ретиноевую кислоту и 1 мкМ примофина. На шестой и седьмой дни культивируйте эмбриональные тельца в двух средах, дополненных 0,2 мкМ ретиноевой кислоты и 1 мкМ примофина. После восьми дней культивирования большинство эмбриональных телец экспрессируют GFP и готовы к диссоциации; обработайте их трипсином и подсчитайте количество клеток, как и ранее.

Затем ресуспендируйте их до концентрации 3,5 × 10⁵ клеток на мл в среде OPC. Перенесите три миллилитра суспензии в среде OPC в чашки диаметром 60 мм, покрытые полиорнитином. Примерно каждую неделю клетки достигнут конфлюэнтности и будут выглядеть следующим образом; проведите пассирование клеток, как и ранее, с трехминутной трипсинизацией.

Через 30 дней после первоначального суспендирования. В среде KSR клетки проявляют характеристики предшественников олигодендроцитов для получения спайкинг-OPC. Используйте OPC, полученные из ESL мыши, при степени конфлюэнтности от 50 до 70%.

Замените среду на XPBS, чтобы промыть клетки. Для введения альфа-субъединицы потенциал-зависимого натриевого канала 1.2.

Мы используем набор для анализа натриевых каналов back MAM. Смешайте 1 мл компонента А back MAM с 4 мл 1X PBS. Удалите промывочный раствор PBS и добавьте разведенный компонент.

Инкубируйте при 37 °C в течение двух часов. Замените агент обратной памяти на среду OPC, дополненную компонентами B и C, как описано в наборе. Инкубируйте еще два часа при 37 °C.

После инкубации замените обогащенную среду на свежую среду для OPC. После еще 24 часов культивирования можно провести анализ полученных из ESL OPC на наличие спайкинга. EBS не проявляют флуоресценции GFP.

ЭБС демонстрируют сильную экспрессию GFP и готовы к культивированию в расщепленном состоянии примерно через 30 дней после исходного ресуспендирования. В среде KSR большинство клеток иммуноположительны при окрашивании на NG2, что согласуется с экспрессией GFP. Однако, в отличие от ОПЦ головного мозга, эти ОПЦ, полученные из клеток МЭС, не генерируют потенциалы действия даже при деполяризации клеток до нуля милливольт.

После введения субъединицы NAV 1.2 посредством вирусной трансдукции эти производные от MES-клеток OPC начинают возбуждаться и генерировать потенциалы действия. Мы только что продемонстрировали вам, как дифференцировать эмбриональные стволовые клетки мыши в OPC и получать спайкающие OPC с помощью вирусной трансдукции. При выполнении данной процедуры важно помнить о правильном хранении ретиноевой кислоты, морфина и FGF 2, всегда использовать свежие аликоты и утилизировать излишки ретиноевой кислоты после использования.

На этом всё. Спасибо за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.