Узорные Фотостимуляция с цифровыми устройствами Micromirror по расследованию Дендритные интеграции между точками ветвления

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы контролировать сложные световые паттерны во времени и пространстве, чтобы их можно было использовать для стимуляции нейронов. Это достигается путем предварительного позиционирования чипа DMD в соответствующей сопряженной плоскости изображения на оптическом пути микроскопа. Вторым этапом процедуры является правильное освещение DMD с помощью интенсивного источника света, такого как лазер.

Третьим этапом процедуры является устранение крапчатого эффекта когерентного освещения. Заключительным этапом процедуры является интеграция графического пользовательского интерфейса для манипулирования чипом DMD. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие, что эксперименты, которые ранее были трудновыполнимы, теперь могут быть завершены относительно легко с помощью многосайтового лизиса кейтового нейромедиатора с использованием системы DMD.

Здравствуйте, меня зовут Майкл Мохаммед, и я работаю в лаборатории доктора Чаман Танга на факультете неврологии Университета штата Мэриленд. Сегодня мы покажем вам процедуру генерации сложных паттернов элиминации в оптическом микроскопе. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения дендритной интеграции.

Итак, приступим. Этот протокол продемонстрирует работу цифрового микрозеркального устройства или системы освещения DMD для экспериментальной нейробиологии. DMD — это оптический полупроводниковый чип с несколькими сотнями тысяч микроскопических подвижных зеркал, расположенных в прямоугольном массиве На его поверхности положение каждого зеркала соответствует пикселю изображения.

Каждое зеркало может быть индивидуально управляемо для наклона между двумя ориентациями. В выключенном положении свет направлен в сторону от оптической оси освещения образца. Во включенной ориентации свет направлен вдоль оптической оси.

ДМД хорошо подходит для лизиса, потому что он хорошо воспринимает очень интенсивный ультрафиолетовый свет, обеспечивает высокую контрастность между включенными и выключенными пикселями и может переключаться между двумя состояниями за десятки микросекунд. Применение DMD в биомедицинских исследованиях облегчается широким использованием программного и аппаратного обеспечения для обработки изображений, а также коммерческим интересом в области отображения изображений. Модульные компоненты продаются компанией Texas Instruments в виде комплектов для обнаружения DLP, которые предоставляют вспомогательные электронные драйверы для адаптации DMD к микроскопической системе.

Необходимо понимать основные понятия, касающиеся оптики микроскопии. Базовый современный флуоресцентный микроскоп состоит из тракта визуализации и тракта освещения. Он состоит из объектива, фильтрующего куба и двух отдельных трубчатых линз для изображения и пути освещения.

Микроскоп спроектирован таким образом, чтобы его положения были сопряжены с плоскостью изображения образца, где объекты, сфокусированные на плоскости образца, также будут казаться в фокусе на этих сопряженных плоскостях изображения. Следствием этой концепции является то, что любое яркое изображение, созданное на сопряженной плоскости изображения, также будет четко проецироваться на плоскость изображения образца. Эта стратегия используется для проецирования сгенерированного компьютером рисунка освещения на образец.

Лазерный луч служит очень ярким источником света, который будет освещать рисунок, реализуемый микрозеркалами на чипах DMD, расположенных в сопряженной плоскости изображения. Конструкция системы освещения DMD зависит от возбуждающих ламп, используемых в оптогенетических экспериментах, в которых используется свет в видимой длине волны. Подсвеченный узор можно провести через траекторию камеры.

Таким образом, чип DMD можно просто установить на один из двух портов камеры модуля с двумя портами камеры. И наоборот, для экспериментов, в которых используется свет в ультрафиолетовом диапазоне, таких как лизис соединений в клетке, свет должен быть проведен через путь эпиосвещения и должна быть создана более доступная сопряженная плоскость изображения. Это связано с тем, что объектив с тубусом изображения не предназначен для пропускания ультрафиолета.

Вместо этого светоносная трубка используется для пропускания ультрафиолета и выполняет адекватную работу по формированию изображения. Каждое микрозеркало на DMD может переключаться между положительным и отрицательным наклоном на 12 градусов относительно плоскости чипа. В зависимости от цифровых входных данных, которые он получает от компьютера, ось вращения проходит по диагональным углам каждого зеркала, под углом 45 градусов к прямоугольным сторонам чипа.

Ориентация наклона зеркала обозначается треугольником золотистого цвета в одном углу на передней поверхности фишки. Наклон микрозеркала определяет выравнивание шага и азимут входящего луча освещения. Чтобы осветить DMD, сначала настройте шаг луча освещения на расстоянии 24 градуса от перпендикулярной оси микросхемы DMD и настройте азимут перпендикулярно оси вращения зеркала.

Точное выравнивание луча имеет решающее значение для эффективной работы. Для экспериментов по лизису. Используйте лазерный источник для генерации фокусируемого луча высокой интенсивности, необходимого для быстрого снятия цепи.

Здесь используется квазидиодный лазер с непрерывной диодной накачкой, твердотельный лазер с тройной частотой и низкой мощностью, использующий лазер относительно высокой мощности, потому что только небольшая часть лазерного излучения фактически доставляется к образцу. При использовании системы DMD запустите выход лазера в многомодовое волокно, чтобы его можно было легко расположить и сориентировать вдоль правильной оси для подсветки DMD, чтобы обеспечить решение проблемы спекла. Проблема, возникающая при когерентном освещении, пропускает свет через оптическое волокно.

Волокно наматывается на электрический натяжитель волокна pazo, который колеблется с частотой около 40 килогерц. Микроскопическое растяжение волокна достаточно для того, чтобы сдвинуть пятнистый рисунок много раз в течение миллисекунды каждого импульса фотостимуляции, тем самым эффективно устраняя пятнышко. Наконец, выходной сигнал оптического волокна сопоставляется с объективом УФ-микроскопа для освещения DMD для совместной регистрации пикселя ПЗС-матрицы с программным обеспечением для обработки изображений DMD, которое соотносит отдельные зеркала DMD с конкретными пикселями ПЗС-камеры.

Графический интерфейс пользователя в программном обеспечении позволяет пользователю назначать ориентацию зеркала DMD, которая соответствует области на ПЗС-изображении с помощью компьютерной мыши с помощью графического интерфейса пользователя. Отметьте место для фотостимуляции, наведя курсор на изображение, отображаемое на экране компьютера, и щелкните отмеченную область, чтобы запрограммировать хранилище шаблонов подачи света. Шаблон, отмеченный на экране компьютера в виде серии отдельных изображений, программирует время лазерных импульсов для каждого пространственного шаблона в программном обеспечении.

Это будет интегрировано с программой сбора данных P clamp. Наконец, используйте программу сбора данных для координации синхронизации работы электроники DMD, стробирования лазера и получения электрического сигнала от целевого нейрона. Здесь показана калибровка разрешения оптической системы.

Минимальный размер пятна показан как измеренный с помощью флуоресцентной мишени. Эффективное физиологическое разрешение измеряется амплитудой протекания тока в зависимости от фотостимуляции. Положение пятна здесь, глутамат в клетке был сфотографирован рядом с дендритной ветвью диаметром два микрометра.

По мере того, как место передвигалось. Ортогонально поперек дита проиллюстрированы электрические реакции на фотостимуляцию различной интенсивности. Показаны реакции зажатого напряжения в зависимости от интенсивности лизиса.

Распределенная дендритная стимуляция может быть легко реализована с помощью системы на основе DMD. Здесь интенсивность ввода варьировалась путем увеличения количества пятен фотостимуляции, отмеченных кружками на двух дендритных ветвях. Пространственное суммирование может быть нелинейным по точкам ветвей.

Он становится все более суперлинейным с увеличением амплитуд входных данных, поступающих на две двери в ответвления. Эти результаты ясно иллюстрируют нелинейный способ суммирования по точкам дендритного ветвления. Сверхлинейность в значительной степени опосредована NMDA-рецепторами, а не потенциал-зависимыми каналами.

Это можно продемонстрировать, поскольку применение двух антагонистов NMDA, A PV и MK 8, 0, 1, в значительной степени устраняет нелинейное поведение. Мы только что показали вам базовую конструкцию и работу системы на основе DMD для фотостимуляции нервной ткани. Система может быть адаптирована для стимуляции видимым светом, например, для оптогенетических экспериментов.

Он также может быть адаптивным к ближнему ультрафиолетовому излучению, используемому для однофотонного лизиса. При выполнении этой процедуры важно помнить, что если используется свет с длиной волны менее 400 нанометров и большинство людей проходит через путь эпиосвещения, точное выравнивание луча в пределах нескольких градусов имеет решающее значение, и что если используется когерентный свет, то необходимо эффективно устранить спекы. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.