Погрузка на грузовые кинезин Powered молекулярной Автобусы

Общая цель данной процедуры заключается в нагрузке наносфер на микротрубочки, которые скользят по поверхности, покрытой моторными белками кинезином. Для этого сначала поверхность стеклянной проточной кюветы покрывают раствором казеина. Вторым этапом процедуры является адсорбция моторных белков кинезина на поверхности проточной кюветы.

Третьим этапом процедуры является добавление микротрубочек. Заключительным этапом является добавление молекул стрептавидина, которые свяжутся с микротрубочками, с последующим добавлением наносфер. Наносферы связываются с поверхностью проточной кюветы, где они могут быть захвачены микротрубочками.

В конечном итоге с помощью флуоресцентной микроскопии можно наблюдать, как наносферы захватываются микротрубочками и перемещаются по поверхности. Здравствуйте, я Элейн Джен Смит из лаборатории доктора Генри Хесса и факультета материаловедения и инженерии Университета Флориды. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру проведения инвертированного анализа моторики.

Мы используем данную процедуру в нашей лаборатории для изучения загрузки груза на микротрубочки и перемещения молекулярных шаттлов. Итак, приступим. Перед началом данной процедуры freshly приготовьте все основные растворы, как описано в текстовой части этого видео.

После приготовления стоковых растворов приступите к подготовке микротрубочек, пипетируя 25 µL раствора для роста в микроцентрифужную пробирку объемом 0,65 мл. Затем добавьте 6,25 µL раствора для роста к 20 µg лиофилизированного биотинилированного тубулина. Перемешайте раствор на вортексе и поместите его в водяную баню при 37 °C на 30 минут для полимеризации; после инкубации разведите раствор в 100 раз в буфере Taxol и осторожно перемешайте на вортексе.

Данный раствор служит для стабилизации микротрубочек. Маркируйте раствор как MT 100 и храните его при комнатной температуре. Затем сделайте десятикратный разведение MT 100 в буфере против выцветания и маркируйте полученный раствор как MT 1000.

Затем подготовьте кинезиновые моторы, разбавив раствор кинезина в 20 раз в буфере TP. Маркируйте раствор как «кинезин 20» и храните его на льду. В завершение приготовьте растворы стрептавидина и наносфер.

Сначала добавьте стрептавидин, меченный Alexa Fluor 568, до концентрации 100 nM в буфер Antifa. Пометьте этот раствор как STV 100, затем разведите наносферы в 5 000 раз в буфере Antifa и пометьте полученную смесь как NS 5 000. Храните оба этих раствора на льду.

После приготовления раствора для анализа загрузки содержимого сконструируйте проточную кювету, используя предметное стекло и покровное стекло, разделенные двусторонним скотчем. Сначала приклейте две полоски двустороннего скотча по краям предметного стекла, оставив между ними зазор около одного сантиметра. Затем наложите поверх скотча покровное стекло.

Надавите на покровное стекло плоским краем пинцета, чтобы обеспечить герметичность. Созданная проточная ячейка имеет длину примерно два сантиметра, ширину один сантиметр и высоту 100 микрон, а ее объем составляет приблизительно 20 µL. Приступайте к сборке инвертированной системы для анализа.

Поместите кончик пипетки между покровным стеклом и предметным стеклом. Затем введите раствор казеина в концентрации 0.5 mg/mL в проточную кювету. Данное покрытие проточной кюветы позволит кинезину сохранить функциональность после абсорбции.

Подождите пять минут, чтобы раствор казеина покрыл поверхность. Затем адсорбируйте кинезин в проточной кювете, вводя раствор киназы; растворы вводят в проточные кюветы, помещая кончик пипетки между покровным стеклом и предметным стеклом. После этого раствор впрыскивают в проточную кювету с одной стороны, в то время как с другой стороны он одновременно отводится за счет капиллярного эффекта.

С помощью фильтровальной бумаги подождите пять минут, чтобы киназа впиталась. Затем введите микротрубочки в проточную кювету, пипетируя раствор MT 1000 в кювету. Подождите пять минут, чтобы микротрубочки осели и прикрепились к моторным белкам киназы после их связывания.

Покройте микротрубочки флуоресцентным strep TTR, введя раствор STV 100 в проточную кювету. Подождите пять минут, чтобы молекулы strep TTR связались с микротрубочками. Удалите избыток strep TTR, трижды промыв проточную кювету раствором Antifa по 30 microliter за один раз.

Наконец, введите биотинилированные полистирольные флуоресцентные наносферы, пипетировав раствор NS 5, 000 в проточную кювету. Поверхность адсорбирует их стационарно. Наносферы будут сталкиваться с движущимися микротрубочками и закрепляться на них.

В данном эксперименте используется флуоресцентный микроскоп eclipse TE 2000 U, оснащенный иммерсионным объективом 100 x, системой X site, лампой one 20 и камерой exon E-M-C-C-D. Сначала нанесите одну каплю иммерсионного масла на объектив. Затем установите проточную кювету на предметный столик микроскопа, используя фильтр-куб trixy.

Настройте фокус на микротрубочках, затем переключитесь на фильтр-куб Fitzy для визуализации наносфер. Далее откройте программу And or I exon и установите режим сбора данных на кинетический. Используйте время экспозиции 0.5 seconds, длину кинетической серии 20 и время кинетического цикла six seconds.

Переключите микроскоп с окуляра на камеру и начните получение изображений. Для первых четырех снимков используйте куб trixi для визуализации микротрубочек. Для следующих 12 снимков переключитесь на куб с фильтром Fitz для получения изображений наносфер.

Затем переключитесь обратно на фильтр-куб trixi. Для получения последних четырех изображений микротрубочек используется фильтр-куб Trissy, затем фильтр-куб переключается на fite. Для визуализации наносфер в данном случае стрелками отмечены наносферы, транспортируемые микротрубочками. Не все наносферы были захвачены микротрубочками.

Теперь показано положение наносфер спустя 36 секунд, что демонстрирует их смещение. При повторной визуализации микротрубочек становится очевидно, что они также переместились по полю зрения. Эти изображения доказывают, что наносферы были смещены вследствие транспорта по микротрубочкам.

Мы только что продемонстрировали вам, как проводить анализ инвертированной подвижности. При выполнении этой процедуры важно не забывать переключать фильтры в процессе получения изображений, чтобы можно было видеть как микротрубочки, так и наносферы. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.