Погрузка на грузовые кинезин Powered молекулярной Автобусы

Общая цель данной процедуры — закрепить наносферы на микротрубочках, которые скользят по поверхности, покрытой моторными белками кинезином. Для этого сначала поверхность стеклянной проточной кюветы покрывают раствором казеина. Вторым этапом процедуры является адсорбция моторных белков кинезина на поверхности проточной кюветы.

Третьим этапом процедуры является добавление микротрубочек. Заключительный этап процедуры заключается в добавлении молекул стрептавидерина, которые свяжутся с микротрубочками, с последующим добавлением наносфер. Наносферы связываются с поверхностью проточной кюветы, где они могут быть захвачены микротрубочками.

В конечном итоге с помощью флуоресцентной микроскопии можно наблюдать, как наносферы захватываются микротрубочками и транспортируются по поверхности. Здравствуйте, меня зовут Элейн Джен Смит, я представляю лабораторию доктора Генри Хесса и кафедру материаловедения и инженерии Флоридского университета. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру проведения инвертированного анализа подвижности.

Мы используем данную процедуру в нашей лаборатории для изучения загрузки груза на микротрубочки и перемещения молекулярных челноков. Итак, приступим. Перед началом данной процедуры свежеприготовьте все основные растворы, как описано в текстовой части этого видео.

После приготовления стоковых растворов приступите к подготовке микротрубочек, перенеся 25 µL раствора для роста в микроцентрифужную пробирку объемом 0,65 мл. Затем добавьте 6,25 µL раствора для роста к 20 µg лиофилизированного биотинилированного тубулина. Перемешайте раствор на вортексе и поместите его в водяную баню при 37 °C на 30 минут для полимеризации; после инкубации разведите раствор в 100 раз буфером Taxol и осторожно перемешайте на вортексе.

Данный раствор служит для стабилизации микротрубочек. Маркируйте раствор как MT 100 и храните его при комнатной температуре. Затем сделайте десятикратное разведение MT 100 в антифейдинговом буфере и маркируйте полученный раствор как MT 1000.

Затем подготовьте кинезиновые моторы, разбавив раствор кинезина в 20 раз в буфере TP. Маркируйте раствор как «кинезин 20» и храните его на льду. В завершение приготовьте растворы стрептавидина и наносфер.

Сначала добавьте стрептавидин, меченный Alexa Fluor 5 6 8, до концентрации 100 nano molars в буфере Antifa. Маркируйте раствор как STV 100, затем разведите наносферы в 5 000 раз в буфере Antifa и маркируйте эту смесь как NS 5, 000. Храните оба раствора на льду.

После приготовления растворов для анализа загрузки груза соберите проточную кювету, используя предметное стекло и покровное стекло, разделенные двусторонним скотчем. Сначала приклейте две полоски двустороннего скотча по краям предметного стекла, оставив между ними зазор около одного сантиметра. Затем наложите сверху покровное стекло на скотч.

Надавите на покровное стекло плоским краем пинцета, чтобы обеспечить герметичность. Созданная проточная кювета имеет длину примерно два сантиметра, ширину один сантиметр и высоту 100 microns, а её объем составляет приблизительно 20 microliters. Приступите к сборке инвертированной системы анализа.

Поместите кончик пипетки между покровным стеклом и предметным стеклом. Затем введите в проточную ячейку раствор казеина с концентрацией 0,5 mg/mL. Данное покрытие проточной ячейки позволит кинезину сохранить свою функциональность после абсорбции.

Подождите пять минут, чтобы раствор казеина покрыл поверхность. Затем адсорбируйте кинезин в проточной кювете, вводя раствор кинезина в концентрации 20; растворы вводят в проточные кюветы, помещая кончик пипетки между покровным стеклом и предметным стеклом. Затем раствор вводится в проточную кювету с одной стороны, в то время как с другой стороны он одновременно вытягивается фильтровальной бумагой.

С помощью фильтровальной бумаги дайте киназе в течение пяти минут впитаться. Затем введите микротрубочки в проточную ячейку, пипетируя раствор MT 1000 в ячейку. Подождите пять минут, чтобы микротрубочки осели и прикрепились к моторным белкам киназы после их связывания.

Покройте микротрубочки флуоресцентным strep TTR, введя раствор STV 100 в проточную кювету. Подождите пять минут, чтобы молекулы strep TTR связались с микротрубочками. Удалите избыток strep TTR, трижды промыв проточную кювету раствором Antifa по 30 microliter за одну промывку.

Наконец, введите биотинилированные полистирольные флуоресцентные наносферы, пипетируя раствор NS 5, 000 в проточную ячейку. Поверхность адсорбирует их стационарно. Наносферы будут сталкиваться с движущимися микротрубочками и закрепляться на них.

В данном эксперименте используется флуоресцентный микроскоп eclipse TE 2000 U, оснащенный иммерсионным объективом 100 x, системой позиционирования X site, лампой one 20 и камерой exon E-M-C-C-D. Сначала нанесите одну каплю иммерсионного масла на объектив. Затем установите проточную кювету на предметный столик микроскопа, используя фильтр-куб trixy.

Сфокусируйтесь на микротрубочках, затем переключитесь на фильтр-куб Fitzy для визуализации наносфер. Далее откройте программу And or I exon и установите режим сбора данных «кинетический» (kinetic). Используйте время экспозиции 0.5 seconds, длину кинетической серии 20 и время кинетического цикла six seconds.

Переключите микроскоп с окуляра на камеру и начните получение изображений. Для первых четырех снимков используйте куб trixi для визуализации микротрубочек. Для следующих 12 снимков переключитесь на фильтр-куб Fitz для получения изображений наносфер.

Затем снова переключитесь на фильтр-куб trixi. Для получения последних четырех изображений микротрубочек используется фильтр-куб Trissy; далее фильтр-куб переключается на fite. Для визуализации наносфер здесь стрелками отмечены наносферы, транспортируемые микротрубочками. Не все наносферы были захвачены микротрубочками.

Теперь показано положение наносфер через 36 секунд, что демонстрирует их смещение. При повторной визуализации микротрубочек становится очевидно, что они также переместились по полю зрения. Эти изображения доказывают, что наносферы были смещены вследствие транспорта по микротрубочкам.

Мы только что продемонстрировали вам, как проводить анализ инвертированной подвижности. При выполнении этой процедуры важно не забывать переключать фильтры при получении изображений, чтобы можно было видеть и микротрубочки, и наносферы. На этом все.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.