Генома Анализ аминоацилирования (зарядка) уровни тРНК Использование Microarrays

Общая цель следующего эксперимента заключается в определении относительных изменений уровней зарядки тРНК. Это достигается путем выделения РНК при низком pH до и после обработки для выделения тРНК с сохранными уровнями зарядки. На втором этапе РНК подвергается обработке периодатным окислением, что позволяет определить относительные уровни зарядки.

Затем образцы лигируют с флуоресцентным олигонуклеотидом и гибридизуют на микрочипе для измерения изменений уровней лигирования в результате зарядки A-T-R-N-A. Изменения геномного уровня зарядки TRNA в клетках CHO на основе технологии микрочипов TRNA. Здравствуйте, я Джон Зай из лаборатории доктора Пана с кафедры биохимии и молекулярной биологии Чикагского университета.

Сегодня я продемонстрирую вам процедуру выделения и измерения уровня зарядки тРНК на геномном уровне. В нашей лаборатории мы используем этот метод для оценки изменений зарядки тРНК при воздействии стрессоров. Итак, приступим.

Для выделения общей фракции тРНК начните с выращивания эквивалента минимум 30 OD 600 дрожжевых клеток, что должно обеспечить получение 30 мкг общей РНК. Осадите клетки в настольной центрифуге. Ресуспендируйте клетки в растворе лизирующего буфера. Добавьте равный объем ацетата натрия, насыщенного хлороформом и фенолом, и перемешайте на вортексе в течение 30 секунд, после чего выдержите на льду не менее 30 секунд.

Повторите перемешивание в вортексе и гомогенизацию еще два раза. Центрифугируйте образец при 18 600 RFC в течение 15 минут при температуре четырех градусов Цельсия. Затем удалите водный слой и проведите еще одну экстракцию насыщенным ацетатом фенилхлороформа после второй экстракции.

Осадите РНК, добавив 2,7 объема этанола, и центрифугируйте при 18 600 RFC в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Ресуспендируйте осадки РНК в растворе лизирующего буфера, после чего повторите осаждение этанолом второй раз. В завершение суспендируйте РНК в растворе, содержащем 10 millimolar буферного ацетата и one millimolar EDTA, для последующей обработки.

Образец можно стабильно хранить при температуре -80 °C еще около двух недель. Хранение не рекомендуется, так как некоторые заряженные TNA начнут дезацилироваться до проведения маркировки с помощью пяти флуоресцентных олигонуклеотидных меток S3 или SCI. Общий TRNA подвергают обработке периодат-окислением, что позволяет определить относительные уровни зарядки; смешайте общий RNA с 0,066 µM каждого стандарта eco irna и 100 мM ацетатным буфером в присутствии 50 мM периодата натрия. Для контрольного образца TRNA, который не будет окислен, используйте 50 мM хлорида натрия вместо периодата натрия.

Инкубируйте реакционные смеси в течение 30 минут при комнатной температуре, затем остановите реакцию, добавив глюкозу до концентрации 100 millimolar, и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. После остановки реакции проведите замену буфера с помощью спин-колонки G 25, чтобы удалить из образцов остатки пропионата натрия. Осадите образцы, добавив буферизованный ацетат до конечной концентрации 133 millimolar, хлорид натрия до конечной концентрации 66 millimolar и 2.7 объема этанола.

Затем изолируйте образцы тРНК с помощью Resus, суспендировав их в 50 millimolar tris HCL и инкубируя при 37 °C в течение 30 минут. По истечении 30 минут нейтрализуйте реакцию, добавив равный объем 50 millimolar буферного ацетата и 100 millimolar хлорида натрия, и осадите продукт, добавив 2,7 объема этанола. Ресуспендируйте осадок РНК в воде до концентрации примерно одна µg/µL.

После проверки качества РНК контрольных и окисленных образцов с помощью электрофореза в агарозном геле можно приступать к флуоресцентному мечению для присоединения флуоресцентных олигонуклеотидных меток к тРНК. Смешайте 0,1 µg/µL денатурированной РНК с 4 µM SI3 или SI5, содержащими олигонуклеотиды, лигазным буфером, 15% DMSO, 0,5 U/µL T4 ДНК-лигазы и дрожжевой экзофосфатазой; инкубируйте при 16 °C более 16 часов. После лигирования смешайте образцы с четырьмя объемами ацетата калия и хлорида калия, затем проведите экстракцию равным объемом фенол-хлороформа. После экстракции водной фазы осадите препараты РНК этанолом. Наконец, ресуспендируйте осадки РНК в воде до концентрации примерно 0,1 µg/µL перед гибридизацией; промойте предметные стекла для микрочипов дистиллированной водой в течение одной-двух минут для удаления несвязавшихся олигонуклеотидов.

Затем смешайте пять меченных образцов S3 или SCI со 140 мкл буфера для гибридизации, содержащего ДНК семенной жидкости лосося до конечной концентрации 140 мкг/мл и поли-А до конечной концентрации 7 мкг/мл; запустите программу гибридизации на автоматическом гибридизаторе микрочипов. Мы настоятельно рекомендуем использовать автоматический гибридизатор для работы с тРНК, так как при ручной гибридизации возникает высокий уровень фонового сигнала. По завершении программы гибридизации промойте стекла раствором Wash 3 вручную, осторожно встряхивая их в конической пробирке объемом 50 мл в течение 3–5 минут.

Промойте предметные стекла не менее двух раз в пробирках, предварительно обернутых алюминиевой фольгой. Для достижения оптимальных результатов высушите стекла путем центрифугирования на низкой скорости в течение пяти-10 минут. Сканирование предметных стекол следует проводить сразу после их высушивания.

Слайды можно сканировать от двух до трех раз без заметного ухудшения качества изображения; здесь представлены репрезентативные результаты правильно выделенного образца тотальной РНК и его анализа. Данный образец имеет очень чистый спектр с соотношением OD 260 к OD 280 около 2, без обнаруживаемого загрязнения белками или фенолом при электрофорезе в 1% агарозном геле. Как окисленные, так и контрольные образцы должны демонстрировать выраженную полосу РНК, при этом наличие других возможных полос нуклеиновых кислот может варьироваться в зависимости от организма.

Если образец заметно слабее других или наблюдается размытие (шмеринг), такие образцы не следует использовать для микрочипов. Микрочипы должны иметь очень низкий уровень фонового сигнала, который на порядок ниже сигнала самого слабого зонда TRNA. Я только что продемонстрировал вам, как изолировать TRNA и определять относительные уровни их зарядки при выполнении данной процедуры.

Важно помнить о необходимости предотвращать попадание нуклеаз в реагенты, особенно на этапах окисления и разбавления. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.