Инъекция в хвостовую вену: метод введения раковых клеток для метастатических исследований на мышиной модели

Начните с добавления трипсина в чашку Петри, содержащую меченые клетки рака молочной железы, чтобы отделить их от поверхности. Добавьте среду, содержащую сыворотку, чтобы остановить действие трипсина. Перенесите суспензию ячейки в коническую пробирку и центрифугируйте ее в ячейке для гранул.

Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в фосфатно-солевом буфере. Поместите трубку на лед, чтобы замедлить клеточный метаболизм. Загрузите эту суспензию ячейки, содержащую необходимое количество клеток, в шприц с замком Люэра и закрепите на ней иглу.

Поместите мышь в ограничитель для грызунов хвостом наружу. Опустите хвост в теплую воду, чтобы расширить вены. Есть две вены на боковых сторонах и артерия на вентральной стороне хвоста. Протрите хвост спиртом, введите иглу и введите клеточную суспензию.

Попадая в кровоток, введенные раковые клетки проникают в органы, такие как легкие, и размножаются. Медленно извлеките иглу и с помощью стерильной марли надавите на место инъекции, чтобы остановить кровотечение. Верните мышь в клетку и обеспечьте полное восстановление. В следующем протоколе мы демонстрируем введение меченых метастатических раковых клеток в мышиную модель для количественной оценки метастазирования и колонизации рака молочной железы.

Отсадите среду и промойте клеточные пластины с помощью 1X PBS. Трипсинизируйте клетки 5 миллилитрами трипсина на 15-сантиметровую пластину в течение двух-пяти минут и перенесите все клетки в коническую трубку. Промойте оставшиеся клетки из чашки для культивирования тканей достаточным количеством полной питательной среды, чтобы погасить трипсин. Добавьте смывку в ту же коническую трубку. Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек, чтобы определить общее количество ячеек.

Затем центрифугируйте клетки при 122-кратном G в течение трех минут и отсасывайте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 1X PBS в желаемой концентрации. Здесь 25 000 клеток вводятся в каждую мышь в 100 микролитрах PBS, поэтому ресуспендированные клетки имеют 250 000 клеток на миллилитр. Держите клеточные суспензии на льду до инъекции.

Работая в вытяжке в помещении для животных, аккуратно, но тщательно перемешивайте клетки, переворачивая трубку или используя шприц объемом 1 миллилитр, чтобы обеспечить их равномерное ресуспендирование. Теперь загрузите 1-миллилитровый шприц с замком Люэра с клеточной суспензией и удалите лишние пузырьки воздуха. Поместите иглу 30-го калибра диаметром 1/2 дюйма на шприц скосом вверх и выдавите пузырьки воздуха.

Аккуратно поместите мышь в удерживатель от грызунов. Боковая хвостовая жилка должна быть видна и расширена. Если нет, аккуратно ущипните основание хвоста и опустите хвост в теплую воду из-под крана, чтобы расширить вены. Используйте спиртовую салфетку для очистки хвоста. Затем введите иглу в хвостовую вену скошенной стороной вверх и введите 100 микролитров клеточной суспензии. Если игла правильно введена в вену, она должна легко скользить немного вперед и назад, при нажатии на поршень не должно быть сопротивления.

Успешные инъекции также должны привести к покраснению, при котором синий цвет вены становится белым в течение нескольких секунд после инъекции. Медленно извлеките иглу и, используя стерильную марлю, надавите на место инъекции, чтобы остановить кровотечение. Верните мышь в клетку и наблюдайте за ней в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное восстановление.