Хемотаксиса Реакция морской микроорганизмов к Micro-Scale питательных слоев

Здравствуйте, меня зовут Маркос. Я работаю с профессором Романом Столкером на кафедре гражданского и экологического строительства в MIT, и я покажу вам, как изготовить микроканал с помощью метода фотолитографии. Для начала нам необходимо разработать фотошаблон.

Перед вами маска, которая представляет собой окончательный проект микроканала, который мы намерены создать. Это проект инжектора, который позволит нам создать тонкий слой питательной среды, в которую мы поместим плавающих микроорганизмов, чтобы пронаблюдать за их хемотаксисом; а здесь находится канал с боковой полостью для создания микровихря внутри этой полости, что будет продемонстрировано на видео позже. После получения маски мы берем пластины, переносим их в «чистую зону» и помещаем в чашку Петри. Сейчас мы направляемся в «чистую зону».

Итак, после того как маска была напечатана и подготовлена, мы переходим в чистое помещение для проведения непосредственного микрофабричного изготовления. Сейчас я возьму пластину чистого кремния, которую я недавно приобрел, и хочу убедиться в ее абсолютной чистоте, используя следующие три растворителя. Первым этапом будет очистка с помощью ацетона, а затем незамедлительно — метанола.

Затем следует финальный этап — промывка изопропанолом. Мы работаем на глянцевой стороне пластины, которая подготовлена к нанесению покрытия. Теперь я высушу её потоком азота.

После высушивания пластину помещают в печь при температуре около 130 °C и запекают в течение 5–10 минут. Тем временем, пока пластина запекается, можно подготовить два нагревательных стола: один при температуре 65 °C, другой — 95 °C. По истечении пяти минут запекания пластину извлекают из печи и оставляют при комнатной температуре примерно на пять минут.

После этого мы переходим к нанесению покрытия методом центрифугирования. Перед заливкой фоторезиста необходимо убедиться в отсутствии частиц пыли на поверхности; для этого мы обдуваем пластину струей азота. Движение при обдуве осуществляется от центра к краям.

Теперь я налью фоторезист на поверхность этой подложки. Наливают примерно три миллилитра. Старайтесь держать флакон как можно ниже, чтобы при наливании фоторезиста на подложку не образовывались пузырьки.

Теперь дайте фоторезисту подействовать на пластине около минуты, прежде чем приступать к центрифугированию. Как я уже упоминал, я создам слой покрытия толщиной 100 мкм. Для этого установим общее время вращения 55 секунд и запустим центрифугу.

Сначала мы постепенно увеличиваем скорость вращения от нуля до 500 RPM в течение пяти секунд и поддерживаем эту скорость около 10 секунд, чтобы убедиться, что фоторезист покрывает всю пластину; затем скорость увеличивают до 3000 RPM в течение примерно семи секунд и поддерживают ее в течение 30 секунд. После нанесения фоторезиста на пластину я помещаю ее на нагревательную поверхность для предварительного запекания при 65 °C в течение пяти минут и при 95 °C в течение 20 минут. По завершении предварительного запекания при 95 °C образец охлаждают до комнатной температуры, но перед этим выдерживают при 65 °C около двух-трех минут, чтобы избежать резкого перепада температуры.

Затем мы оставляем образец при комнатной температуре примерно на пять минут для охлаждения. Теперь я подвергну его воздействию УФ-излучения, чтобы облученная часть затвердела, а необлученная часть была удалена при последующей промывке. В этом месте мы используем маску, и, как вы видите, маска состоит из двух частей: прозрачной области и области, которая в данной конфигурации полностью непрозрачна или черна.

Теперь я помещу эту маску поверх покрытой пластины. Маска, которую вы получаете от типографии, имеет две стороны. Одна из них — та, на которой нанесен принт чернилами.

Это область, которую необходимо привести в контакт с пластиной. Теперь я облучу пластину через маску УФ-светом. В целях безопасности я надену эти защитные очки.

Время экспозиции зависит от используемого SUA, а также от толщины, которой необходимо достичь. После экспонирования я помещаю пластину на нагревательную плитку с температурой 65 °C и снова подвергаю ее прогреву в течение пяти минут, а затем при температуре 95 °C в течение 20 минут. Напоминаю, что время прогрева зависит от желаемой толщины, а также от используемого типа SUA.

После этого этапа мы приступим к проявлению пластины. Под проявлением понимается удаление ненужной части фоторезиста, чтобы на пластине осталась только экспонированная область. Для проявления пластины и смыва ненужной части фоторезиста мы используем проявитель.

В данном случае я использую поменальный ацетат в качестве проявителя; я налью этот растворитель в стакан, помещу туда пластину и оставлю её погруженной примерно на 10 минут. Опять же, время зависит от толщины слоя и используемого растворителя. Спустя 10 минут видно, что на пластине остался только рисунок желаемого канала, а все ненужные области были смыты; теперь достаточно просто промыть образец.

Мы используем тот же растворитель (свежий), тот же ацетат полилона, и просто распыляем его на поверхность пластины, чтобы промыть ее. В завершение, чтобы удалить растворитель, мы промываем пластину изопропанолом. После этого мы просушиваем ее струей азота.

Теперь у вас есть чистая подложка с нанесенным на нее необходимым рисунком. Мы называем ее мастер-формой. Теперь мы возвращаемся в лабораторию, чтобы залить ее PDMS и продолжить выполнение остальной части процедуры.

Итак, мы вернулись из «чистой комнаты», и у нас есть мастер-форма, которая фактически служит шаблоном для дальнейших действий. Далее мы зальем PDMS — это полимер, который подвергнется отверждению. Как видно, если залить полимер поверх этой формы, на нем образуются соответствующие желобки, и в итоге, после приклеивания к стеклянной подложке, этот полимер сам станет каналом.

Теперь мы подготовим PDMS. Перед нами PDMS — полимер, полидиметилсилоксан. И это отвердитель.

Я налью этот отвердитель в стакан, затем добавлю в него PDMS и перемешаю их в соотношении 1:10. Обычно для однородного перемешивания используется палочка. В процессе перемешивания образуется множество пузырьков, которые служат индикатором того, было ли содержимое перемешано.

Теперь, после смешивания PDMS с отвердителем, мы готовы залить эту смесь поверх матрицы, которой в данном случае является пластина. Чтобы пластина не сдвинулась во время заливки, мы закрепили ее лентой. Перед тем как залить PDMS на пластину, необходимо максимально очистить её поверхность от пыли, которая могла на неё осесть.

Теперь мы включаем компрессор, чтобы очистить пластину от пыли. Как видите, в ПДМС много пузырьков. Мы удалим эти пузырьки, поместив образец в вакуумную камеру.

Таким образом, вакуумирование занимает примерно 30 минут для удаления всех пузырьков. После удаления пузырьков образец извлекают и помещают в печь при температуре 65 °C, где его выдерживают не менее 12 часов. По истечении 12 часов пластина будет готова к резке.

Я воспользуюсь этим ножом, чтобы разрезать PDMS и снять его с подложки, а затем использую этот просекатель, чтобы пробить отверстия для впускных и выпускных трубок. При разрезании ведите ножом до тех пор, пока он не коснется подложки, но не прилагайте слишком сильное давление, чтобы не разбить подложку, и сделайте разрез вокруг вашего канала. Теперь снимите слой.

Теперь вы можете видеть, что это канал, который представляет собой паттерн с кремниевой пластины. Таким образом, видно, что они идентичны. Теперь этот паттерн был гравирован на данном полимере, PDMS.

После приклеивания этого слоя к стеклянной подложке получится канал для нашего эксперимента. Следующий важный шаг — не забыть проделать отверстия, чтобы мы могли вставить входные и выходные порты в микроканалы после их создания в PDMS. Для этого мы использовали скотч, чтобы заклеить сторону канала, где находится желобок.

Мы заклеиваем этот канал скотчем, чтобы удалить все частицы пыли. Следующим этапом является плазменное соединение. Перед началом плазменного соединения, которое будет проводиться в другой лаборатории, мы удалим ленту, чтобы открыть поверхность, которую необходимо соединить — а именно эту поверхность и предметное стекло, — после чего подвергнем их воздействию кислородной плазмы и соединим их друг с другом для обеспечения адгезии.

Здравствуйте, меня зовут Джастин Сеймур, я доктор postdoctoral-исследователь в лаборатории Романа Стокера в MIT. Мои исследования сосредоточены на микробной экологии, а именно на том, как морские микробы находят скопления питательных веществ в океане. Для изучения подобных паттернов мы используем методы микрофлюидики.

Таким образом, мы будем использовать канал, способ изготовления которого Маркус продемонстрировал ранее, после проведения плазменного бондирования. После этого канал можно использовать в микрофлюидном эксперименте. Перед началом эксперимента необходимо подготовить подложки, которые будут использоваться в работе.

В сегодняшнем эксперименте мы рассмотрим, как морской фитопланктон Donella turcica способен находить микромасштабные участки с пищей. В данном случае пищей является аммоний, и мы предоставим его в концентрации 100 µM. В этих экспериментах мы можем визуализировать участки с пищей, добавив флуоресцентный краситель к питательным веществам, которые мы предоставляем организмам.

Для этого мы используем краситель флуоресцеин. Сейчас я добавляю пипеткой флуоресцеин до конечной концентрации 100 micromolar к аммонию, который служит питательным веществом. Затем мы можем визуализировать это питательное вещество с помощью флуоресцентной микроскопии, что позволяет нам наблюдать за диффузией пятна питательных веществ и изучать реакцию организмов на это пятно.

В экспериментах с микрофлюидикой мы используем стеклянные шприцы. Первым делом необходимо добавить соответствующие субстраты и организмы в шприцы, которые будут использоваться. Следующим шагом является подключение трубок к микрофлюидной установке.

Это выполняется на предметном столике микроскопа. Мы помещаем микрофлюидный канал на предметный столик микроскопа, затем вставляем трубки во входные и выходные отверстия. После этого мы устанавливаем резервуар для отходов и проверяем, чтобы он был заполнен жидкостью наполовину, так чтобы трубка в резервуаре для отходов была полностью погружена в жидкость.

Это позволяет поддерживать постоянное давление внутри канала. Затем мы подсоединяем шприцы к трубкам, которые подают в микрофлюидный канал организмы (в данном случае *Donella litoralis*) и питательный субстрат (в данном случае аммоний). После этого мы настраиваем микроскоп и проверяем правильность расположения микрофлюидного канала перед началом экспериментов.

Когда канал будет установлен в нужном положении, мы переключимся на просмотр канала с помощью камеры и сможем визуализировать его на компьютере. Теперь можно выполнить более точную настройку фокуса, после чего станет виден инжектор, с помощью которого вводятся питательные вещества. Он представляет собой встроенный в микрофлюидный канал проволочный наконечник иглы диаметром 100 мкм.

Кроме того, мы можем создать градиент питательных веществ, вводя их в систему. С этого момента и до начала экспериментов необходимо удалить все пузырьки воздуха, которые могли попасть в микрофлюидную систему. Для этого мы используем шприц, заполненный в данном случае искусственной морской водой, который можно подключить к микрофлюидному каналу через клапан.

Затем мы нажимаем на шприц, чтобы удалить пузырьки воздуха из канала. Удалить пузырьки можно одним из двух способов: либо вытеснить их через выход за счет давления, создаваемого шприцем, либо удалить их через стенки из материала PDMS, который проницаем для газов. После удаления пузырьков, когда система готова к началу эксперимента, мы устанавливаем соответствующие скорости потока для введения материалов в канал с помощью шприцевого насоса.

В данном случае мы используем скорость потока 2 µL/min, что соответствует скорости потока в канале 266 µm/s. После установки соответствующей скорости потока можно начать эксперимент, запустив поток, который создает узкую полосу питательных веществ. Чтобы визуализировать питательные вещества в момент их впрыскивания в канал из точки инъекции, мы добавляем в них краситель флуоресцеин и наблюдаем за ними с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии. Затем мы можем изучить динамику патчей, остановив поток в микрофлюидном канале и визуализируя полосу питательных веществ, диффундировавших латерально из их первоначального положения.

Затем мы переключаемся на фазово-контрастную микроскопию, чтобы визуализировать организмы, плавающие в канале, и определить их положение относительно участка с питательными веществами. Мы реализуем это путем записи последовательности кадров с частотой 10 кадров в секунду, что позволяет создать видеоролик для наблюдения за этими организмами. После этого мы можем визуализировать плавающих организмов, вычисляя временную разницу между двумя отдельными кадрами путем вычитания одного кадра из предыдущего, чтобы в поле зрения остались только движущиеся объекты.

Таким образом мы можем удалить фоновый шум с изображений. Затем мы записываем видео с регулярными интервалами в течение 10–20 минут после первоначального высвобождения питательного пятна. Используя программное обеспечение для анализа изображений для наложения позиций организмов из одного кадра последовательности на другой, мы можем отслеживать изменения положения этих организмов, чтобы получить данные об их траекториях плавания, на основе которых затем можно получить более детальную информацию о статистике их перемещения, включая скорость и изменение направления.

Таким образом, эти эксперименты впервые позволили нам непосредственно изучить, как морские микробы способны находить и использовать микромасштабные скопления питательных веществ. Это может иметь важные последствия для трофической динамики и круговорота питательных веществ в океане. В продолжение слов Джастина, то, как микроорганизмы, и особенно бактерии, взаимодействуют со своей пищей в океане, может оказывать значительное влияние на биохимические циклы.

Однако океан вовсе не статичен; в нем существуют различные условия потока, такие как турбулентность, создаваемая ветром на поверхности. В масштабе микроорганизмов то, что они воспринимают и с чем сталкиваются, представляет собой не столько общую турбулентность, сколько сдвиг, при этом мельчайшие остатки турбулентности известны как колмогоровские вихри. В данной работе мы стремимся изучить, как именно такие вихри влияют на плавательное поведение микроорганизмов.

И для этого мы создаем еще один канал, используя ту массу, которую я демонстрировал ранее. В центре находится полость. Позвольте мне нарисовать ее, чтобы увеличить схему.

Вот так выглядит канал: перед нами вид сверху. Мы подаем поток слева направо, и из-за сдвига внутри этой полости образуется рециркуляционная зона. Данная полость представляет собой модель гранулы Addis. Мы можем использовать ту же установку, о которой Джастин рассказывал ранее; когда шприцевой насос выключен и поток не запущен, видно, что бактерии плавают внутри этой полости практически случайным образом и свободно.

Предпочтительная ориентация отсутствует. Видео, которое вы видите, представляет собой запись разности временных интервалов — это именно та техника, которую использует Джастин. Таким образом, при очень быстром потоке, как видно на видео, бактерии уносятся вихрем.

Траектория самих бактерий следует линии тока вихря. Но что на самом деле более интересно, так это следующее: когда мы включаем шприцевой насос. При этом скорость не слишком высока.

Скорость недостаточно высока, чтобы бактерии не могли ей противостоять. Тем не менее, на этом видео все еще можно заметить сходство с вихрем. Таким образом, в ходе этого эксперимента мы выяснили, что при наличии очень сильного турбулентного потока бактерии оказываются во власти этого потока и не способны ему противостоять.

Тем не менее, в зоне умеренной турбулентности они по-прежнему способны плавать самостоятельно.